elisa講義(編輯修改稿)
2024-11-19 05:25 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 磷酸鹽緩沖液。,第二十四頁，共四十九頁。,3.2 ELISA的試劑準備 B,結合物 即酶標記的抗體（或抗原）是ELISA中關鍵的試劑 1. 酶的催化活性 2. 抗體（或抗原）的免疫活性 3. 含有或少含有游離的抗體（或抗原） 4. 結合物尚要有良好的穩(wěn)定性。,第二十五頁，共四十九頁。,酶 純度高，催化反應的轉化率高，專一性強，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，受檢標本中不存在相同的酶。 酶結合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。 在ELISA中，HRP（辣根過氧化物酶），AP（堿性磷酸酶），葡萄糖氧化酶，βD半乳糖苷酶和脲酶等。 HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。,結合物用的抗原和抗體 制備結合物時所用純度較高的IgG，以免在與酶聯(lián)結時其他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進行反應，實驗結果本底淺淡。在ELISA中用酶標抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。,第二十六頁，共四十九頁。,3.3 試劑準備 C 酶的底物,DH2+ H2O2 D+ 2H2O DH2為供氧體， H2O2為受氫體。 DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。 DH2如：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和ABTS 。 OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結合物最常用的底物。 TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍色。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應用液。酶反應終止后，TMB產(chǎn)物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為450nm。 ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。,E,3.3.1 HRP的底物,HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide)。,第二十七頁，共四十九頁。,AP的底物為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯作為底物。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應后，黃色可穩(wěn)定一時間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。,3.3.2 AP的底物,3.3.3 酶反應終止液 常用的HRP反應終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。,第二十八頁，共四十九頁。,3.4 對照設定,陽性對照品(positive control)和陰性對照品(negative control)是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結果的對照。 陽性對照品的基本組成應盡量與檢測標本的組成相一致，多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質(zhì)。 加入的量應與試劑的敏感度相稱； 在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較，可以估計標本物質(zhì)的量。,第二十九頁，共四十九頁。,參考標準品,定量測定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測定等）應含有制作標準曲線用的參考標準品，應包括覆蓋可檢測范圍的45個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中.,陰性對照品須先行檢測確定不含待測物質(zhì)。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。,第三十頁，共四十九頁。,酶標基本步驟,用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法: 1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡稱洗滌，下同)。 2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。 3. 加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。 4. 加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml 37℃10～
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