【文章內(nèi)容簡介】 滴法、懸滴法、暗視野聚光法均用于觀察細菌動力。暗視野聚光法使用暗視野顯微鏡可觀察螺旋體及其動力。三、細菌接種與培養(yǎng)技術(shù)液體培養(yǎng)基是在肉浸液中加入1%%NaCl，蛋白胨的作用為提供細菌生長繁殖所需的氮源。%～。固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中加入2%～3%的瓊脂。細菌L型的培養(yǎng)基必須采用高滲（3%～5%NaCl、10%～20%蔗糖等）低瓊脂培養(yǎng)基。制備好的培養(yǎng)基放于4℃活冷暗處一般可以保存一周，最多不超過2周。平板劃線接種法一般用于含有多種細菌的標本，利用此接種法可以得到單個菌落，分為分區(qū)劃線法和連續(xù)劃線法。分區(qū)劃線法下一區(qū)應與上一區(qū)接觸3～4次，此方法多用于含菌量多的標本，如糞便、濃汁、痰液等標本。連續(xù)劃線法多用于含菌量少的標本。斜面接種法主要用于純種增菌及保留菌種或生化反應。穿刺接種法可用于觀察細菌動力，有鞭毛的細菌可沿穿刺線擴散生長。液體接種法多用于普通肉湯、蛋白胨水等液體培養(yǎng)基接種。1細菌在液體培養(yǎng)基上的生長現(xiàn)象有三種，分別是：①混濁（大多數(shù)細菌）；②沉淀（鏈狀生長的細菌，如鏈球菌、炭疽芽孢桿菌等）；③菌膜（專性需氧菌，如銅綠假單胞菌等）。1血瓊脂上的溶血現(xiàn)象：α溶血：又叫草綠色溶血，菌落周圍血培養(yǎng)基變?yōu)榫G色環(huán)狀。β溶血：又稱完全溶血，菌落周圍形成一個完全清晰透明的環(huán)。γ溶血：即不溶血，菌落周圍的培養(yǎng)基沒有變化；紅細胞沒有溶解或無缺損。雙環(huán)：上層溶血環(huán)，內(nèi)層為θ溶血，外層為α溶血。如產(chǎn)氣莢膜梭菌。1傾注平板法用于水、牛乳、飲料及尿液等液體標本的細菌計數(shù)。1常用的厭氧培養(yǎng)法有：①皰肉培養(yǎng)基法；②焦性沒食子酸法；③厭氧罐法；④氣袋法；⑤厭氧手套箱法，⑥氣體噴射法。1最常用的營養(yǎng)培養(yǎng)基：血平板和巧克力平板。1鑒別培養(yǎng)基：如糖發(fā)酵管、三糖鐵培養(yǎng)基、枸櫞酸鹽培養(yǎng)基、克氏雙糖鐵瓊脂（KIA）、伊紅美藍瓊脂和動力吲哚尿素（MIU）等培養(yǎng)基。1選擇培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入某種化學成分或抗生素以抑制某些細菌的生長，而有助于需要的細菌生長，此培養(yǎng)基稱為選擇培養(yǎng)基。如SS瓊脂，其中的膽鹽能抑制革蘭陽性菌，因而使沙門菌、志賀菌容易得到分離。1增菌培養(yǎng)基：如乙型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌的生長需含血液或血清的培養(yǎng)基；霍亂弧菌的增菌常用堿性蛋白胨水。1特殊培養(yǎng)基：包括厭氧培養(yǎng)基和細菌L型培養(yǎng)基。巰基乙醇酸鈉是特殊培養(yǎng)基。厭氧培養(yǎng)基如皰肉培養(yǎng)基；細菌L型培養(yǎng)基是針對細胞壁缺陷的細菌L型，由于胞內(nèi)滲透壓較高，培養(yǎng)基必須采用高滲低瓊脂培養(yǎng)基。細菌血液培養(yǎng)使用的抗凝劑為聚苯乙烯磺酸鈉（SPS）。四、細菌生化鑒定技術(shù)（一）碳水化合物代謝試驗碳水化合物代謝試驗包括：糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗、葡萄糖氧化/發(fā)酵試驗、甲基紅試驗（MR）、VP試驗、β半乳糖苷酶試驗（ONPG）、七葉苷水解試驗。甲基紅試驗的原理是細菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，加入甲基指示劑變紅為試驗陽性。VP試驗出現(xiàn)紅色為陽性，ONPG出現(xiàn)黃色為陽性，七葉苷水解試驗出現(xiàn)黑色為陽性。VP試驗常與甲基紅試驗一起使用，因為前者陽性的細菌，后者通常為陰性。七葉苷水解試驗主要用于D族鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別，前者為陽性（黑色）。（二）蛋白質(zhì)和氨基酸代謝試驗蛋白質(zhì)和氨基酸代謝試驗包括：靛基質(zhì)（吲哚）試驗、硫化氫試驗、尿素酶試驗、苯丙氨酸脫氨酶試驗、氨基酸脫羧酶試驗。吲哚試驗是由于細菌有色氨酸酶，可以分解色氨酸而產(chǎn)生吲哚，與對二甲基苯甲醛反應生成紅色化合物，本試驗呈現(xiàn)紅色為陽性。硫化氫試驗是細菌能分解含硫氨基酸，產(chǎn)生的H2S與Fe2+反應呈黑色為陽性。主要用于腸桿菌科中屬及種的鑒別。如沙門菌屬、愛德華菌屬、亞利桑那菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬細菌，絕大多數(shù)硫化氫陽性，其他菌屬陰性。沙門菌屬中也有硫化氫陰性菌種。尿素酶試驗是細菌分解尿素生成氨，使培養(yǎng)基呈堿性，指示劑變紅為陽性。苯丙氨酸脫氨酶的陽性結(jié)果為綠色，氨基酸脫羧酶的陽性結(jié)果為培養(yǎng)基從黃色變?yōu)樽仙?。（三）碳源利用試驗碳源利用試驗包括枸櫞酸鹽利用試驗和丙二酸鹽利用試驗。枸櫞酸鹽利用試驗的陽性結(jié)果為深藍色，陰性為綠色。丙二酸鹽利用試驗的陽性結(jié)果為深藍色。枸櫞酸鹽利用試驗在腸桿菌科中埃希菌屬、志賀菌屬、愛德華菌屬和耶爾森菌屬均為陰性，沙門菌屬、克雷伯菌屬通常為陽性。（四）酶類試驗觸酶試驗：細菌能催化過氧化氫生成水和氧氣，出現(xiàn)氣泡為陽性。氧化酶試驗：某些細菌具有細胞色素氧化酶，能將二甲基對苯二胺或四甲基對苯二胺氧化成紅色的化合物，出現(xiàn)紅色為陽性。凝固酶試驗：主要用于金黃色葡萄球菌的鑒定。DNA酶試驗：細菌產(chǎn)生DNA酶分解DNA，是菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)。葡萄球菌、沙雷菌、變形桿菌均為陽性。硝酸鹽還原試驗：出現(xiàn)紅色為陽性。若加入試劑后無顏色反應，可能是：①硝酸鹽沒有被還原，試驗陰性；②硝酸鹽被還原為氨和氮等其他產(chǎn)物而導致假陰性結(jié)果，這時應在試管內(nèi)加入少許鋅粉（還原劑），如出現(xiàn)紅色則表明試驗確實為陰性。若仍不產(chǎn)生紅色，表示試驗為假陰性。（五）其他及藥敏鑒定試驗CAMP試驗：B群鏈球菌能產(chǎn)生CAMP因子，可促進葡萄球菌的β溶血素溶解紅細胞的活性，因此在兩菌（B群鏈球菌和葡萄球菌）的交界處溶血力增加，出現(xiàn)箭頭狀或矢形（半月形）的溶血區(qū)。在鏈球菌中，只有B群鏈球菌CAMP試驗陽性，故可作為特異性鑒定。膽汁溶菌試驗：膽汁或膽鹽可溶解肺炎鏈球菌，可能是由于膽汁降低細胞膜表面的張力，使細胞膜破損或使菌體裂解；或者是由于膽汁加速了肺炎鏈球菌本身自溶過程，促使細菌發(fā)生自溶。O/129抑菌試驗：O/129抑菌試驗為藥敏試驗，0／129（二氨基喋啶）對弧菌屬細菌有抑制作用，而對氣單胞菌屬細菌無抑制作用。桿菌肽試驗：A群鏈球菌對桿菌肽幾乎全部敏感，而其他群鏈球菌絕大多數(shù)對其耐藥。奧普托欣（Optochin）試驗：幾乎所有肺炎鏈球菌對奧普托欣試驗敏感，而奧普托欣試驗對其他鏈球菌則無抑制作用。五、細菌毒力鑒定▲內(nèi)毒素常采用鱟試驗——內(nèi)毒素激活鱟試劑中凝固酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟堂?，凝固蛋白原生成凝固蛋白。▲外毒素常用體內(nèi)及體外毒力試驗檢測，也用ELISA法測定。第五章細菌對抗菌藥物的敏感試驗一、臨床常用抗菌藥物（一）β內(nèi)酰胺類常見藥物主要是青霉素類、頭孢菌素類和單環(huán)β內(nèi)酰胺類（氨曲南和卡蘆莫南）。作用機制：β內(nèi)酰胺類抗生素的作用機制相似，均是與青霉素結(jié)合蛋白（PBP）結(jié)合，抑制細菌細胞壁合成，致使細菌死亡。（二）氨基糖苷類作用機制：①依靠離子的附作用，吸附在菌體表面，造成膜的損傷；②和細菌核糖體30S小亞基發(fā)生不可逆結(jié)合，抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的合成，造成遺傳密碼的錯讀，產(chǎn)生無意義的蛋白質(zhì)。種類：①鏈霉菌屬：如鏈霉素、卡那霉素、妥布霉素、核糖霉素、巴龍霉素、新霉素；②小單胞菌屬：如慶大霉素、福提霉素；③半合成氨基苷類：阿米卡星、奈替米星、地貝卡星等，氨基苷類抗菌藥物對需氧G桿菌有較強的抗菌活性，對G+球菌有一定的活性。（三）喹諾酮類作用機制：①通過外膜孔蛋白和磷脂滲透進入細菌細胞；②作用于DNA旋轉(zhuǎn)酶，干擾細菌DNA復制、修復和重組。種類：①第一代：為窄譜抗菌藥物，對G+球菌無作用；主要作用于大腸埃希菌，且迅速出現(xiàn)耐藥，較少應用于臨床。②第二代：對G和G+細菌均有作用；比較這類藥的抗菌活性強度依次為環(huán)丙沙星、氧氟沙星、羅美沙星、氟羅沙星、培氟沙星、諾氟沙星；③第三代：對G+菌作用高于第二代的4～8倍，對厭氧菌亦有作用；司帕沙星、妥舒沙星、左氧氟沙星、加替沙星、格帕沙星、莫西沙星等。（四）大環(huán)內(nèi)酯類作用機制：可逆結(jié)合細菌核糖體50S大亞基的23S單位，抑制細菌蛋白質(zhì)合成和肽鏈延伸；種類：國內(nèi)常用有紅霉素、吉他霉素、麥迪霉素、乙酰螺旋霉素。新一代大環(huán)內(nèi)酯類有克拉霉素、羅紅霉素、地紅霉素、氟紅霉素、阿奇霉素和乙酰麥迪霉素。（五）其他抗菌藥物▲磺胺類：競爭性第與二氫葉酸合成酶結(jié)合，阻止核酸形成?！沫h(huán)素類：阻止酰胺基轉(zhuǎn)移酶RNA與mRNA核糖體的受體位點結(jié)合。分為短效（土霉素、四環(huán)素）、中效（地美環(huán)素、美他環(huán)素）和長效（多西環(huán)素、米諾環(huán)素）?！让顾仡?、林克霉素類：能與細菌核蛋白體50S亞基結(jié)合，使蛋白質(zhì)合成呈可逆性抑制?！请念悾簩儆跉⒕鷦?，能與一個或多個肽聚糖合成中間產(chǎn)物形成復合物，阻斷肽聚糖合成，阻止細胞壁合成。包括萬古霉素、去甲萬古霉素、替考拉寧、多粘菌素、桿菌肽等。◆大環(huán)內(nèi)酯類的抗生素是抑菌劑。二、抗菌藥物敏感試驗方法▲細菌多抗菌藥物的敏感分為三種現(xiàn)象：敏感（S）、耐藥（R）、中介（I）。（一）擴散法（KB法）目前常用的方法，是一種半定量的方法。采用的接種方法是平板涂布法。抑菌圈的大小可以反映待檢菌對測定藥物的敏感程度，與該藥對待檢菌的最低抑菌濃度（MIC）呈負相關(guān)，即抑菌圈愈大，MIC愈小。含藥紙片貼于含菌瓊脂表面時應注意：①各紙片中心距離不小于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應大于15mm；②一旦碰觸培養(yǎng)基就不可再動；③平板最好單獨平放，不超過兩個疊放。采用標準菌株是進行質(zhì)控的主要措施?！艚瘘S色葡萄球菌ATCC25923，大腸埃希菌ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC27853，糞腸球菌ATCC29212或ATCC33186。～，過高或過低的pH值會影響藥物效能。堿性可擴大氨基糖苷類藥物的抑菌圈，酸性可擴大四環(huán)素類藥物的抑菌圈?！锲渌哳l考點MBC為最低殺菌濃度。體外聯(lián)合藥物敏感試驗的FIC（部分抑菌濃度指數(shù)）：FIC指數(shù)＜協(xié)同作用；～1相加作用；FIC指數(shù)1～2無關(guān)作用；FIC指數(shù)＞2拮抗作用。抗結(jié)核分枝桿菌的首選一線藥物是異煙肼、利福平。產(chǎn)ESBL菌株臨床上用β內(nèi)酰胺類抗生素（青霉素類、頭孢菌素類及氨曲南）治療無效。耐甲氧西林金葡菌(MRSA)用β內(nèi)酰胺類抗生素治療無效。產(chǎn)AmpC酶菌株對β內(nèi)酰胺類抗生素（青霉素類、頭孢菌素類及氨曲南）及含酶抑制劑復合制劑耐藥。治療有效的藥物主要有碳青霉烯類(亞胺培南)和第四代頭(頭孢吡肟、頭孢匹羅)以及某些喹酮類和氨基糖苷類抗生素。藥敏試驗時，10^8/ml含菌量。第六章各菌屬特征匯總●葡萄球菌屬葡萄球均屬是一類觸酶試驗陽性的革蘭陽性（G＋）球菌，無鞭毛和芽胞，某些菌株能形成莢膜。包括金黃色、表皮、腐生、溶血葡萄球菌。葡萄球菌觸和鏈球菌鑒別用觸酶試驗，葡萄球菌觸酶陽性，鏈球菌是陰性。葡萄球菌的致病性用凝固酶試驗，致病性葡萄糖球菌為陽性，還可以分解甘露醇產(chǎn)酸，耐熱DNA酶陽性。主要見于金黃色葡萄球菌。葡萄球菌的細胞壁上有葡萄球菌A蛋白（SPA），可以與人類IgG的Fc段結(jié)合，可進行協(xié)同凝集試驗。葡萄球菌抵抗力強，耐熱、耐干燥、耐高鹽，是抵抗力最強的無芽胞細菌。耐甲氧西林的金葡菌（MRSA），耐甲氧西林的表葡菌（MRSE），耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌（VRSA），耐萬古霉素的表皮葡萄球菌（VRSE），MRSA的首選抗生素為萬古霉素。表皮葡萄球菌為醫(yī)院感染的重要病原菌，它是導致血培養(yǎng)污染的常見細菌之一。腐生葡萄球菌是導致尿路感染的常見病原菌之一?！锟吹侥堂?、耐熱DNA酶陽性，就選金黃色葡萄糖球菌?！矜溓蚓鷮冁溓蚓鷮偈且淮笕河|酶試驗陰性、在液體培養(yǎng)基上呈鏈狀排列的革蘭陽性（G＋）球菌，但在陳舊培養(yǎng)基或被吞噬細胞吞噬后常呈革蘭陰性（G－）。無鞭毛、無芽胞。肺炎鏈球菌矛頭狀排列，由于其能產(chǎn)生自溶酶，菌落呈臍窩狀，鑒別試驗：奧普托欣試驗（Optochin），陽性、膽汁溶菌試驗陽性、莢膜腫脹試驗陽性、草綠色溶血圈。本菌是社區(qū)獲得性肺炎的最常見病原菌。A群鏈球菌用桿菌肽試驗鑒別，為陽性。可產(chǎn)生溶血素和紅疹毒素，前者在血平板上形成β溶血環(huán)，后者引起猩紅熱。對人類有致病性的90%屬A群。B群鏈球菌可以水解馬尿酸和CAMP試驗陽性。D群鏈球菌七葉苷試驗陽性。草綠色鏈球菌是引起亞急性心內(nèi)膜炎最常見的病原菌。鏈球菌感染引起的變態(tài)反應疾病為風濕熱、腎小球腎炎，為Ⅲ?；撔枣溓蚓a(chǎn)生的酶有脫氧核糖核酸酶（鏈道酶）、透明質(zhì)酸酶（擴散因子）、鏈激酶（溶解纖維蛋白酶）。因為有這幾種酶的的產(chǎn)生，化膿性鏈球菌感染的病灶范圍廣、膿液稀薄、邊界不清。根據(jù)溶血現(xiàn)象的不同，將鏈球菌分為甲型溶血性鏈球菌（α溶血）、乙型溶血性鏈球菌（β溶血）、丙型溶血性鏈球菌（γ溶血）?！衲c球菌屬腸球菌屬是腸道的正常棲居菌。G+，成雙或短鏈狀排列的卵圓形球菌，無芽胞，無莢膜，部分腸球菌有稀疏鞭毛。腸球菌能在高鹽（%NaCl）、高堿（）、40%膽汁培養(yǎng)基上和10℃～45℃環(huán)境下生長；●奈瑟菌屬