20xx年醫(yī)學(xué)專(zhuān)題—生藥資源的開(kāi)發(fā)利用(編輯修改稿)
2025-11-15 13:22 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 多態(tài)性,DNA分子作為遺傳信息的載體,所含信息量大,且具有較高的遺傳穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性,因此通過(guò)(tōnggu242。)直接診斷分析DNA的多態(tài)性可以避開(kāi)遺傳特性表現(xiàn)過(guò)程中的環(huán)境因素、數(shù)量性狀遺傳或部分與完全顯性的干擾,從分子水平上揭示藥材的道地性。 可用于中藥材鑒定的DNA指紋圖譜技術(shù)有4大類(lèi): 1）基于傳統(tǒng)的Southern雜交技術(shù)的分子標(biāo)記如RFLP 2）基于PCR反應(yīng)的分子標(biāo)記如RAPD,DAF等 3）PCRRFLP技術(shù)的結(jié)合即AFLP技術(shù) 4）DNA測(cè)序分析技術(shù)。 近年來(lái),還發(fā)展了基于DNA barcoding(條形碼)技術(shù),該技術(shù)在藥用植物 鑒定中具有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)。,第二十一頁(yè)，共四十一頁(yè)。,RFLP:限制性片段(pi224。n du224。n)長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記技術(shù),RFLP是第一個(gè)被應(yīng)用于遺傳研究的DNA分子標(biāo)記技術(shù)。 限制性?xún)?nèi)切酶能高度專(zhuān)一地識(shí)別和切割DNA序列,不同酶識(shí)別不同的DNA序列,因此可利用內(nèi)切酶的酶解產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的DNA片段,從而揭示DNA序列水平上的多態(tài)性。酶解后的分子量大小(d224。xiǎo)不同的DNA可通過(guò)凝膠電泳來(lái)分離,再將已分離的DNA與放射性核試驗(yàn)素或熒光標(biāo)記的核酸探針?lè)肿与s交,便可獲得信息量大、分辨率高的DNA指紋圖。 RFLP方法技術(shù)步驟繁瑣,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,應(yīng)用不便。,第二十二頁(yè)，共四十一頁(yè)。,RAPD：隨機(jī)(su237。 jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記,采用任意順序的較短的引物擴(kuò)增基因組DNA,可以在不知道特異DNA序列的情況下,檢測(cè)DNA的多態(tài)性。雖然對(duì)每一個(gè)引物而言，其檢測(cè)的基因DNA多態(tài)性是有限(yǒuxi224。n)的，但可用的引物數(shù)很多，可檢測(cè)區(qū)域幾乎覆蓋了整個(gè)基因組，從理論上講，RAPD可以對(duì)整個(gè)基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)。 RAPD技術(shù)目前廣泛用于中藥DNA指紋圖譜的構(gòu)建。 PCR技術(shù)使目的基因極易獲得,再與RFLP聯(lián)用,還產(chǎn)生了PCRRFLP、RAPDRFLP等方法,第二十三頁(yè)，共四十一頁(yè)。,RAPD技術(shù)的一般(yībān)步驟如下：,DNA提取(t237。qǔ)、純化與檢測(cè),PCR反應(yīng)(fǎny236。ng),PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè),數(shù)據(jù)分析,傳統(tǒng)提取方法： CTAB法、SDS法 是在裂解細(xì)胞的基礎(chǔ)上,多次苯酚氯仿等有機(jī)溶劑抽提使蛋白質(zhì)變性沉淀于有機(jī)相,而核酸保留在水相,達(dá)到分離核酸的目的 提取新方法： 螯合樹(shù)脂、特異性DNA吸附膜、離子交換純化柱及磁珠或玻璃粉吸附等,TE溶液(pH8.0)中,用RNA酶酶解或用玻璃奶法純化。 將DNA樣品在某濃度的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,檢測(cè)DNA片段的長(zhǎng)度并估測(cè) DNA的濃度。,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在一定濃度的瓊脂糖凝膠(含濃度0.5μg/ml左右 EB)上電泳,電泳結(jié)果在透射式紫外燈下觀察并照相。,可用二元數(shù)據(jù)(1,0)統(tǒng)計(jì)來(lái)表示帶的有無(wú),用RAP Distance軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)輸入,計(jì)算樣品間的遺傳距離,然后用NTSYSpc軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析,用UPGMA法作聚類(lèi)圖。,第二十四頁(yè)，共四十一頁(yè)。,AFLP：擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性DNA 該方法用一人工接頭(adapter)與限制酶切的基因組DNA片段連接(li225。njiē),制成AFLP模板DNA,合成一系列3c
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