現(xiàn)代分子診斷技術(shù)(編輯修改稿)
2024-10-28 20:26 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 ,原位PCR(in situ PCR,ISPCR ) 在細(xì)胞或細(xì)胞切片上對待測的低拷貝數(shù)基因進(jìn)行擴增，并通過原位雜交進(jìn)行檢測 不僅能檢測出病原微生物的存在，且能夠在組織細(xì)胞中定位,原位雜交（nucleic acid hybridization in situ） 將標(biāo)記探針與細(xì)胞或組織切片中的核酸進(jìn)行雜交，進(jìn)而檢測特異的DNA或RNA序列 細(xì)胞原位雜交 組織切片原位雜交 DNADNA RNADNA 三類雜交 RNARNA 該法優(yōu)點： 不需提取核酸，故可完整保持組織或細(xì)胞的形態(tài)，因而更能準(zhǔn)確地反映組織細(xì)胞的功能狀態(tài),有,噬菌體介導(dǎo)細(xì)菌檢測,將熒光素酶基因引入到噬菌體的基因組，然后用轉(zhuǎn)基因噬菌體去侵染待測樣品 噬菌體侵染該宿主菌，大量合成包括熒光素酶在內(nèi)的由噬菌體基因編碼的蛋白，向體系中加入熒光素和ATP，就會有熒光產(chǎn)生 結(jié)核菌的檢測 抗藥性菌株的檢測,,熒光素酶,熒光素＋ATP,熒光,利用宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、翻譯,噬菌體基因,熒光素酶基因,宿主細(xì)菌,噬菌體介導(dǎo)的細(xì)菌檢測,第三節(jié) DNA指紋,每個人體細(xì)胞內(nèi)都含有23對染色體，每條染色體中部含有一個DNA分子，DNA分子中的核苷酸序列包含著遺傳信息，在DNA分子中存在三種類型：單拷貝序列、中等程度重復(fù)序列、高度重復(fù)序,每個重復(fù)序列在300個核苷酸長度之內(nèi)，由于高度重復(fù)，序列經(jīng)過超離心后以衛(wèi)星帶出現(xiàn)在主要DNA帶的附近，所以也稱衛(wèi)星DNA，其中的重復(fù)序列單元則稱為“小衛(wèi)星DNA” “小衛(wèi)星”具有高度的可變性，但在“小衛(wèi)星DNA “中有一小段序列則在所有個體中都一樣，稱為“核心序列”。如果把核心序列串聯(lián)起來作為分子探針與不同個體的DNA進(jìn)行分子雜交，就會出現(xiàn)各自特有的雜交圖譜。它們與人的指紋一樣具有專一性和特異性，因此稱作“DNA指紋” 通過對人類基因組的解析，發(fā)現(xiàn)人與人之間99．99％的堿基序列都相同，而剩下的0.01%的堿基特征序列則來自于雙親，據(jù)此可用于“親子鑒定”,所羅門的審判：,大家都聽說過所羅門的審判這樣一件故事： 兩位婦人都聲稱自己是孩子的母親，于是 所羅門就命令一名侍衛(wèi)把那個孩子帶來，要用劍將其 辟成兩半分給他們兩， 結(jié)果假母親同意所羅 門的判決，而孩子真 正的母親卻懇求侍衛(wèi) 饒了孩子的性命，她 解釋說：“把孩子給了 假母親，總比讓孩子 慘死好?！碑?dāng)然，真假母親也就水落石出了。,滴骨驗親法：,以生者的血滴在尸骨上，觀察血能否浸入骨內(nèi)，浸入的則被認(rèn)為兩者有血緣關(guān)系，在各種古籍中有多種記錄。 三國時代（公園220—280年）謝承著《會稽先賢傳》中的《以弟血滴兄骨》可能是記錄此法的最早的史料：陳業(yè)的哥哥因海難不幸殞命，當(dāng)時一同遇難的有五六十人，并且尸體都已嚴(yán)重腐敗而無法辨認(rèn)死者的身份。陳業(yè)就用刀刺破自己的手臂將血分別滴在尸骨上，發(fā)現(xiàn)其血液只能浸入一具尸骨，其余皆不能。陳業(yè)就這樣確認(rèn)其兄的尸骨。,合血法：,等到了明代，更是采用了“合血法”來識別親權(quán)。明末清初的檢驗書籍中都有相同的記載：“親子兄弟或自幼分離，欲相認(rèn)識。難辨真?zhèn)?。命各刺出血，滴一器?nèi)，真則共凝為一，否則不凝也。”,方法：,DNA指紋是指對待測樣品中的DNA進(jìn)行分析所得到的具有特征性的DNA分子雜交圖譜 DNA 酶解 電泳 轉(zhuǎn)膜 雜交 最常用的DNA探針是微衛(wèi)星序列,,第四節(jié) 遺傳性疾病的分子診斷技術(shù),直接診斷 點突變 間接診斷 多態(tài)性連鎖分析,美國前副總統(tǒng)漢弗萊Humphrey) 在1967年發(fā)現(xiàn)膀胱內(nèi)有一腫物，病理切片未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞 良性“慢性增生性囊腫”，未進(jìn)行手術(shù)治療。,九年后，他被診斷為患有“膀朧癌”，兩年后死于該病。,1994年，研究者用靈敏的PCR技術(shù)對上述漢弗萊1967年的病理切片進(jìn)行了P53抑癌基因檢查，發(fā)現(xiàn)那時的組織細(xì)胞雖然在形態(tài)上還沒有表現(xiàn)出惡性變化，但其P53基因的第227個密碼子已經(jīng)發(fā)生了一個核苷酸的突變。就是這個基因的微小變化，使其抑癌功能受損，導(dǎo)致九年后細(xì)胞癌變的發(fā)生。這說明，在典型癥狀出現(xiàn)之前的很長時間，細(xì)胞癌變的信息已經(jīng)在基因上表現(xiàn)出來了,P53抑癌基因,遺傳性疾病的分子診斷技術(shù),PCR－酶解鑒定 PCR／OLA鑒定 PCRELISA檢測 PCRDGGE鑒定 擴增阻滯突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system,ARMS） 連接酶鏈反應(yīng)（LCR）,鐮刀形細(xì)胞貧血癥(sicklecell anemia),典型的單基因遺傳性疾病 血紅蛋白的β鏈（β珠蛋白）的第六個氨基酸Glu發(fā)生突變成Val,血紅蛋白 ?鏈上 谷氨酸變成纈氨酸,英國女王維多利亞。她帶有血友病基因，并將其傳給了她的兒女。血友病是一種遺傳性凝血障礙疾病，患者可能因很小的傷口而出血不止導(dǎo)致死亡。血友病在女性一般表現(xiàn)為隱性遺傳，較少發(fā)病，但會傳給后代；在男性則表現(xiàn)為顯性遺傳，顯示出病癥。維多利亞女王在科堡主持的一次歐洲王室成員集會，與會者有17人是她的后裔，其中有她的孫女亞歷山德拉（21），她同俄國沙皇尼古拉二世結(jié)婚，導(dǎo)致他們的兒子患有血友病。,一、PCR－酶解鑒定,正?；驗镃CTGAGG 鐮刀形貧血病患者的基因為CCTGTGG 限制性內(nèi)切酶CvnI的識別序列為CC TNAGG,方法: 在CvnI位點的兩點設(shè)計兩個引物。 包含CvnI位點區(qū)域的DNA片段通過PCR擴增出來。 擴增的DNA用CvnI酶處理，酶解產(chǎn)物用凝膠電泳分開，經(jīng)溴化乙錠染色后就可在紫外燈下檢查DNA帶型。,CvuI處理,CvuI,CvuI,CvuI,256bp,201bp,181bp,88bp,CvuI,CvuI,256bp,382bp,88bp,正常情況,鐮刀形細(xì)胞貧血癥,PCR 擴增,引物1,引物2,PCR產(chǎn)物（長726bp）,二、PCR/OLA鑒定,OLA(oligonucleotid
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