基因診斷與基因治療(編輯修改稿)
2024-10-25 13:31 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 擇和外源基因的導(dǎo)入,病毒載體 RNA病毒載體（逆轉(zhuǎn)錄病毒） DNA病毒：常用的有腺病毒、皰疹病毒、 SV40病毒、巨細(xì)胞病毒、 腺相關(guān)病毒、單純皰疹病毒等 非病毒載體 質(zhì)粒、脂質(zhì)體、受體介導(dǎo)的蛋白,目前應(yīng)用最多的最成功的是逆轉(zhuǎn)錄病毒，病毒感染細(xì)胞后，其基因組RNA 經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生雙鏈DNA拷貝，插入宿主染色體形成前病毒（provirus），前病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的正鏈既是病毒RNA，再與前病毒編碼的外殼蛋白包裝成新的病毒顆粒。 完整的病毒顆粒具有插入宿主染色體必需的全套酶系統(tǒng)，適用于介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移。,逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus）,,,主要來自莫洛尼氏小鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus，MoMLV）其中三個結(jié)構(gòu)基因（gag、pol、env）被刪除 標(biāo)記基因（marker gene）插入空缺，供陽性選擇用。如：新霉素抗性基因（neomycin resistant gene），該基因編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ（NPTⅡ），能對抗新霉素（G418）。 有目的基因的插入位點,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的優(yōu)點,1.可插入足夠長的外源DNA（7KB） 2.基因轉(zhuǎn)移效率高，幾達(dá)100% 3.重組體可整合入宿主染色體，并穩(wěn)定表達(dá)和傳代 4.宿主范圍廣、比較安全,1.只能整合入分裂活躍的細(xì)胞 2.靶細(xì)胞表面需要有特殊的受體 3.必須使用帶有“輔助病毒”的包裝細(xì)胞系 4.病毒滴度低,包裝細(xì)胞：一種細(xì)胞，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能在其中包裝成沒有感染能力的病毒顆粒，但能從中釋放出去，這種細(xì)胞即包裝細(xì)胞。 1.多數(shù)由各種輔助病毒轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞系 NTH3T3構(gòu)成。 2.輔助病毒由MoMLV切除了病毒5’端LTR至Gag起始密碼之間包裝信號ψ等序列，雖能產(chǎn)生病毒蛋白但不能進(jìn)行包裝。 3.導(dǎo)入的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)錄出的RNA可以利用輔助病毒產(chǎn)生的病毒蛋白包裝成假病毒顆粒。,包裝細(xì)胞系,,（四）外源基因表達(dá)的篩選 在較多的表達(dá)載體中都有neor標(biāo)記基因存在，若向培養(yǎng)基中加入藥物G418，未被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不存在neor標(biāo)記基因，細(xì)胞不能存活，最后只有轉(zhuǎn)化細(xì)胞存活下來。,（五） 回輸體內(nèi),1.選擇合適的疾病：單基因遺傳病 2.具備該病分子缺陷的知識 3.有目的基因的克隆 4.克隆基因的有效表達(dá) 5.克隆基因的有效調(diào)節(jié) 6.可利用的動物模型,遺傳病基因治療的必要條件,四、基因治療的應(yīng)用,（一）遺傳病的基因治療,基因治療的部分對象,1.嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷癥（腺苷脫氨酶ADA缺乏） 2.囊性纖維變性 3.Gaucher病Ⅰ型（葡糖腦苷脂酶缺陷） 4.苯丙酮酸尿癥（苯丙氨酸羥化酶缺陷） 5.血友病B（凝血Ⅸ因子缺陷） 6.家族性高膽固醇血癥 7.地中海貧血,1.宿主的修飾：保護(hù)分裂旺盛的正常組織，如造血干細(xì)胞：導(dǎo)入二氫葉酸還原酶基因，獲得對氨甲蝶呤的抗性 2.增強(qiáng)腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）活性： 如將腫瘤壞死因子（TNF）基因?qū)隩IL。這是目前腫瘤基因治療最常用的方法。 3.腫瘤細(xì)胞的修飾,（二）腫瘤的基因治療,如： 自殺基因 + 病毒載體 轉(zhuǎn)染 重組載體,藥物前體 (無毒) Gene→酶→ ↓ 藥物復(fù)合物(有毒),細(xì)胞死亡,
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