【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 性仍保留。病毒屬于微生物界，其不同于其他微生物的特性如下：病毒一般只含有一種核酸DNA或RNA，而其它微生物，包括細(xì)菌、支原體、衣原體、立克次體，則都同時(shí)含有兩種核酸。病毒通過(guò)基因組復(fù)制和表達(dá)產(chǎn)生子代病毒的核酸和蛋白質(zhì)，隨后裝配完整的病毒粒子。病毒缺乏完整的酶系統(tǒng)，不具備其他生物“產(chǎn)能”所需的遺傳信息，因此必須利用宿主細(xì)胞的酶類和產(chǎn)能機(jī)構(gòu)，并借助宿主細(xì)胞的生物合成機(jī)構(gòu)復(fù)制其核酸以及合成由其核酸編碼的蛋白質(zhì)，乃至直接利用細(xì)胞成分。某些RNA病毒的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA（cDNA），與細(xì)胞基因組整合，并隨細(xì)胞DNA復(fù)制而增殖，即所謂的DNA前病毒。病毒沒(méi)有細(xì)胞壁，也不進(jìn)行蛋白質(zhì)、糖和脂類的代謝活動(dòng)，因此對(duì)于干擾微生物的這些代謝過(guò)程而影響微生物結(jié)構(gòu)和功能的抗生素，具有明顯的抵抗力。一個(gè)簡(jiǎn)單的病毒粒子，實(shí)質(zhì)上只是一團(tuán)遺傳物質(zhì)（DNA或RNA）和它外圍的一層蛋白外殼。這層蛋白外殼就是衣殼，衣殼和核酸一起總稱為核衣殼。病毒不含氨基酸，這是病毒與其他微生物，包括細(xì)菌、衣原體、立克次體等又一明顯區(qū)別。病毒的分類系統(tǒng)采用 目、科、亞科、屬和種的等級(jí)制度。屬名應(yīng)是一個(gè)以“virus”結(jié)尾的單詞；亞科“virinae”； 科“viridae”；目“virales” 結(jié)尾的單詞。動(dòng)物病毒“種”的名稱大多引用其所引起疾病的名稱，后加“病毒”，獸醫(yī)學(xué)上則常再加上宿主（動(dòng)物的名稱）種類，也有的在病名前再加最初發(fā)現(xiàn)該病毒的地名。毒珠名稱至少應(yīng)能反映該毒珠的分離地點(diǎn)和時(shí)間以及該毒珠的類別。根據(jù)其病毒核酸組成還可以將病毒分成DNA病毒和RNA病毒。RNA病毒可分為（1）正鏈RNA病毒；（2）負(fù)鏈RNA病毒，正鏈RNA病毒可以直接呈現(xiàn)mRNA的作用，同時(shí)又是合成互補(bǔ)鏈的模板； 一般情況下，正鏈RNA病毒的基因組RNA具有感染性。負(fù)鏈RNA病毒不能直接呈現(xiàn)mRNA的作用，即不能直接指導(dǎo)合成互補(bǔ)鏈。病毒缺乏自身增殖所需的完整酶系統(tǒng)，增殖時(shí)必須依靠宿主細(xì)胞合成核酸和蛋白質(zhì)，甚至直接利用宿主細(xì)胞的某些成分，這就決定了病毒在細(xì)胞內(nèi)專性寄生的特性。病毒的增殖過(guò)程大致可以分為：（1）吸附與侵入、（2）脫殼、（3）病毒成分的合成及裝配、（4）釋放等4個(gè)主要階段。病毒屬于微生物界，其不同于其他微生物的特性如下：病毒一般只含有一種核酸DNA或RNA，而其它微生物，包括細(xì)菌、支原體、衣原體、立克次體，則都同時(shí)含有兩種核酸。病毒通過(guò)基因組復(fù)制和表達(dá)產(chǎn)生子代病毒的核酸和蛋白質(zhì)，隨后裝配完整的病毒粒子。病毒缺乏完整的酶系統(tǒng)，不具備其他生物“產(chǎn)能”所需的遺傳信息，因此必須利用宿主細(xì)胞的酶類和產(chǎn)能機(jī)構(gòu)，并借助宿主細(xì)胞的生物合成機(jī)構(gòu)復(fù)制其核酸以及合成由其核酸編碼的蛋白質(zhì)，乃至直接利用細(xì)胞成分。某些RNA病毒的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA（cDNA），與細(xì)胞基因組整合，并隨細(xì)胞DNA復(fù)制而增殖，即所謂的DNA前病毒。病毒沒(méi)有細(xì)胞壁，也不進(jìn)行蛋白質(zhì)、糖和脂類的代謝活動(dòng)，因此對(duì)于干擾微生物的這些代謝過(guò)程而影響微生物結(jié)構(gòu)和功能的抗生素，具有明顯的抵抗力。一個(gè)簡(jiǎn)單的病毒粒子，實(shí)質(zhì)上只是一團(tuán)遺傳物質(zhì)（DNA或RNA）和它外圍的一層蛋白外殼。這層蛋白外殼就是衣殼，衣殼和核酸一起總稱為核衣殼。病毒不含氨基酸，這是病毒與其他微生物，包括細(xì)菌、衣原體、立克次體等又一明顯區(qū)別。（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、（2）雞胚、（3）體外培養(yǎng)的器官、（4）細(xì)胞，這4種都可以作為人工增殖病毒的基本工具。而大量病毒的，又是病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)研究以及制備疫苗和特異性診斷試劑的先決條件。組織培養(yǎng)：病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖及其對(duì)細(xì)胞的作用，可以根據(jù)細(xì)胞病變、細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)出現(xiàn)血凝素或其他病毒抗原、紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象以及通過(guò)“指示病毒”的干擾等方法加以識(shí)別。組織培養(yǎng)用的玻璃器皿要用（硫酸、重鉻酸鉀）。常用于組織培養(yǎng)的人工綜合營(yíng)養(yǎng)液的主要成分有：氨基酸、糖類、無(wú)機(jī)鹽、維生素、輔助生長(zhǎng)因子等。常用的人工綜合營(yíng)養(yǎng)液為：MEM和RPM1640。用人工綜合營(yíng)養(yǎng)液配制細(xì)胞生長(zhǎng)液時(shí)需要加入①適量血清和谷氨酰胺溶液，②還需要加入規(guī)定量的抗生素溶液防止細(xì)菌污染，③加入碳酸氫鈉溶液修正PH，④根據(jù)情況還可加入HEPES溶液可使生長(zhǎng)液具有較強(qiáng)的PH緩沖能力。能使組織和成片細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞的化學(xué)制劑為胰蛋白酶和EDTA，EDTA使用液又可稱之為Versen溶液，其分散細(xì)胞的作用原理是EDTA可以結(jié)合鈣、鎂離子，使組織細(xì)胞分散。動(dòng)物血清中具有細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的各種營(yíng)養(yǎng)因子，它能促進(jìn)細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)，且有很強(qiáng)的酸堿緩沖能力。細(xì)胞培養(yǎng)液在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中可分為（1）細(xì)胞生長(zhǎng)液（2）細(xì)胞維持液兩種。細(xì)胞生長(zhǎng)液：是使細(xì)胞發(fā)育增殖的液體，因此要求營(yíng)養(yǎng)條件豐厚； 細(xì)胞維持液：用于延緩細(xì)胞代謝，從而延長(zhǎng)細(xì)胞的存活時(shí)間，以利于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。這兩種液體成分的主要區(qū)別是血清含量不同。細(xì)胞生長(zhǎng)適宜的PH范圍是 PH ～。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)全過(guò)程的關(guān)鍵是防止污染。細(xì)胞株的保存是組織培養(yǎng)中一個(gè)十分重要的工作，二甲基亞砜是細(xì)胞低溫保存的良好的保護(hù)劑，含10%二甲基亞砜的血清可以作為懸浮細(xì)胞的液體在液氮中保存細(xì)胞。病毒學(xué)上常用的細(xì)胞類型可分為（1）原代細(xì)胞、（2）二倍體細(xì)胞、（3）傳代細(xì)胞，三大類，原代細(xì)胞培養(yǎng)和傳代細(xì)胞培養(yǎng)的根本區(qū)別在于細(xì)胞是否能在體外無(wú)限傳代。細(xì)胞的純化：細(xì)胞的純化可以用細(xì)胞克隆技術(shù)?？寺∈侵赣脽o(wú)性繁殖方法產(chǎn)生的一組遺傳上相同的細(xì)胞和生物群體的過(guò)程。病毒的分離和鑒定：（P219）病毒對(duì)細(xì)胞的感染性具有嚴(yán)格的選擇性和特異性，因此用組織培養(yǎng)細(xì)胞接種病毒必須首先選擇敏感細(xì)胞。（1）病毒增殖的判定：（略）（2）細(xì)胞病變（CPE）：大部分病毒在敏感細(xì)胞系均可出現(xiàn)CPE（細(xì)胞病變），CPE（細(xì)胞病變）可以表現(xiàn)為嚴(yán)重的細(xì)胞破壞、細(xì)胞腫大、顆粒增多、細(xì)胞融合成合胞體或無(wú)明顯的細(xì)胞變化等。CPE（細(xì)胞病變）經(jīng)常具有病毒“種”的特性，因此常常作為病毒堅(jiān)定依據(jù)。（3）病毒蝕(shi)斑技術(shù)（又稱空斑）：病毒蝕(shi)斑是指病毒在已長(zhǎng)成的單層細(xì)胞上形成的局限性病灶，主要用于病毒的純化或病毒懸液中感染病毒含量的測(cè)定。（用病毒蝕斑技術(shù)測(cè)定含量病毒純化或病毒懸液中感染的病毒）（4）病毒感染力的滴定：有兩種，一種方法是用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物測(cè)定LD50(半數(shù)致死量)；另一種方法是在組織細(xì)胞上測(cè)定TCID50（半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量。（5）病毒的保存：分離或鑒定后的病毒經(jīng)過(guò)冷凍干燥后可以長(zhǎng)期保存。免疫血清學(xué)實(shí)驗(yàn)：免疫血清學(xué)實(shí)驗(yàn)是利用抗原和抗體的特異性結(jié)合的原理進(jìn)行的，主要用于兩個(gè)目的：①?gòu)牟×汐@得病毒株后，應(yīng)用已知的抗病毒血清或單克隆抗體進(jìn)行免疫血清學(xué)試驗(yàn)，鑒定病毒的種類乃至型別；②由發(fā)病動(dòng)物采集血清標(biāo)本，應(yīng)用全病毒或特異性病毒抗原，測(cè)定發(fā)病動(dòng)物體液中的特異性抗體，或進(jìn)一步比較發(fā)病動(dòng)物的急性發(fā)病期和恢復(fù)期血清中的抗體效價(jià)，了解病毒性抗體是否有明顯的增長(zhǎng)，從而判定病毒感染的存在。（1）中和試驗(yàn)：動(dòng)物在受到病毒感染后，在體內(nèi)產(chǎn)生抗體，如果該抗體能與相應(yīng)的病毒粒子特異性地結(jié)合，使后者喪失感染力，這種抗體就成為中和抗體。應(yīng)用已知的病毒或病毒抗原，可以測(cè)知患者體內(nèi)中和抗體的存在及其效價(jià)；用已知的抗病毒血清或中和性單克隆抗體，也可以進(jìn)行病毒的鑒定，因此中和試驗(yàn)也常用于新分離病毒株的鑒定。（2）血凝和血凝抑制試驗(yàn)：許多病毒能夠凝集某些種類動(dòng)物的紅細(xì)胞，病毒凝集的紅細(xì)胞種類隨病毒種類的不同而不同。血凝反應(yīng)可被特異性抗體所抑制，因此血凝抑制試驗(yàn)可以應(yīng)用于：①應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)病毒懸液測(cè)定血清中的相應(yīng)抗體；②應(yīng)用于特異性抗體鑒定新分離的病毒。用枸櫞酸鈉配置的阿氏液具有抗紅細(xì)胞凝集作用，用于血凝和血凝抑制試驗(yàn)中配置紅細(xì)胞懸掖。同一患者急性發(fā)病期和恢復(fù)期雙份血清（相距2～3周）的抗體效價(jià)增高4倍以上者，說(shuō)明本次發(fā)病是由所測(cè)抗體相應(yīng)病毒引起的。（3）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)：一個(gè)抗體分子與抗原結(jié)合后，可以導(dǎo)致數(shù)百個(gè)補(bǔ)體分子的激活，呈現(xiàn)一定程度的放大作用，所以補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)是一個(gè)比較敏感的方法，一般用于人及動(dòng)物血清中特異性抗體的定量檢測(cè)（補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)），也常用于新分離病毒的鑒定。（4）免疫熒光技術(shù)：將抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，再進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，出現(xiàn)熒光就說(shuō)明標(biāo)記物的存在，同時(shí)也反映了抗原或抗體的存在。免疫熒光技術(shù)具有抗原抗體反應(yīng)的特異性和染色技術(shù)的快速性，并可在細(xì)胞水平上進(jìn)行抗原定位，故在病毒學(xué)研究和病毒病的診斷中都是一種應(yīng)用很廣的方法。熒光抗體染色技術(shù)包括（1）直接法、（2）間接法、（3）補(bǔ)體法、（4）SPA(葡萄球菌A蛋白)免疫熒光法。（5）酶免疫技術(shù)：以酶作為標(biāo)記物，通過(guò)化學(xué)方法將其與抗原或抗體共價(jià)結(jié)合，形成酶標(biāo)記物，可與被檢的抗原或抗體起反應(yīng)，形成酶標(biāo)記免疫復(fù)合物。制備酶結(jié)合物的方法很多，目前應(yīng)用最廣泛的有過(guò)碘酸鹽法和戊二醛法。酶免疫測(cè)定試驗(yàn)包括：①間接法（測(cè)抗體）、②雙抗體夾心法（測(cè)抗原）、③IgM捕獲ELISA（酶鏈免疫吸附實(shí)驗(yàn)）、④競(jìng)爭(zhēng)法。IgM是動(dòng)物機(jī)體在受到初次抗原刺激后最早產(chǎn)生的一種抗體球蛋白，因此IgM捕獲ELISA常應(yīng)用于多種病毒病的早期診斷。抗u鏈抗體特異性結(jié)合IgM，可以應(yīng)用于IgM捕獲ELISA。IgG是主要的抗病毒抗體，在第二次抗原刺激時(shí)，由于免疫回憶，發(fā)生迅速的加強(qiáng)反應(yīng)IgG量顯著增高（分子量大）。在病毒病的診斷中，也常將這一原理用于判斷病毒病的感染狀況，但常常需要采集恢復(fù)期和急性期雙份血清進(jìn)行抗體效價(jià)的比較如IgG水平4倍或4倍以上增加具有血清學(xué)診斷意義。（6）膠體金免疫檢測(cè)技術(shù)：膠體金免疫檢測(cè)技術(shù)是以膠體金為載體吸附抗體和抗原，完成檢測(cè)特異性抗原或抗體的。膠體金免疫檢測(cè)技術(shù)優(yōu)于ELISA（酶鏈免疫吸附實(shí)驗(yàn)）法和免疫熒光法的最主要一點(diǎn)是肉眼直接判定結(jié)果。（總結(jié)：膠體金免疫檢測(cè)技術(shù)就是直接用肉眼可以觀察結(jié)果）。病毒病的分子生物學(xué)診斷：分子生物學(xué)診斷的特異性取決于核酸序列的特異性，病毒病的分子生物學(xué)診斷，包括對(duì)病毒核酸和蛋白質(zhì)的測(cè)定。PCR（全稱是聚合酶鏈反應(yīng)），是在引物、摸板DNA和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。由于引物是按照與擴(kuò)增區(qū)段兩端序列彼此互補(bǔ)的原則設(shè)計(jì)的，因此每一條新生鏈的合成都是從引物的退火結(jié)合位點(diǎn)開(kāi)始，并沿著相反鏈延伸。因此，PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）的特異性是由人工合成的一對(duì)寡核苷酸引物所決定的。PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)對(duì)僅有的幾個(gè)拷貝的基因放大數(shù)百萬(wàn)倍，使PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）擴(kuò)增結(jié)果在瓊脂糖凝膠電泳后形成明顯可見(jiàn)的DNA帶。溴化乙錠（EB）可以插入核酸分子之間并在紫外線下放射熒光，因此可以作為核酸分子電泳的指示劑。（核酸分子電泳的指示劑用溴化乙錠EB）。（1）RTPCR(聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù)：由于DNA聚合酶不能以RNA為摸板合成cDNA，所以不能對(duì)RNA病毒核酸進(jìn)行直接PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）。首先必須提取病毒RNA。提取病毒RNA時(shí)，要注意避免RNA酶對(duì)病毒RNA的降解作用。為此，所用的試劑和用品均需要進(jìn)行無(wú)Rnase處理，（Rnas必須使用無(wú)熱原質(zhì)水制備）如加入RNA酶抑制劑或高壓滅菌。加入反轉(zhuǎn)錄酶經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成與病毒RNA互補(bǔ)的DNA(cDNA)，然后才能進(jìn)行PCR（聚合酶鏈反應(yīng)），這就是所謂的RTPCR（逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)）。目前常用的逆轉(zhuǎn)錄酶（RTPCR）包括MMV和AMV。RTPCR（逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)）反應(yīng)的特異性取決于模板和引物，引物序列必須是被檢病毒特異的，原則上要求引物339。端堿基與模板一定要配對(duì)，對(duì)引物539。末端的堿基并沒(méi)有嚴(yán)格的限制，只要與模板DNA結(jié)合的引物長(zhǎng)度足夠，其539。末端堿基可以不與模板DNA匹配而呈游離狀態(tài)，因此對(duì)引物539。末端可以進(jìn)行自由修飾。PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）反應(yīng)中，引物1又稱Watson引物，是與模板正鏈互補(bǔ)的寡核苷酸鏈。（2）核酸雜交檢測(cè)技術(shù)：雜交的基本原理是帶互補(bǔ)序列的單鏈核苷酸相遇時(shí)，會(huì)退火形成雙鏈?！坝糜谠\斷目的”雜交雙方是已知序列的病毒探針和待測(cè)樣品中的病毒核酸，如果是陽(yáng)性結(jié)果說(shuō)明病毒感染的存在。在核酸分子雜交技術(shù)基礎(chǔ)之上又發(fā)展了一系列檢測(cè)DNA和RNA的技術(shù)，如Southrn blotting、Western blotting、Dit blotting和菌落雜交。聚丙烯酰胺凝膠電泳也可簡(jiǎn)稱為PAGE（PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)雜交）DNA限制性內(nèi)切酶可以識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列。利用不同的內(nèi)切酶切割病毒DNA，依據(jù)切割后的片段在凝膠電泳中泳動(dòng)速率不同所形成的電泳帶型做出診斷。（3）病毒病的免疫預(yù)防：決定疫苗免疫效果的關(guān)鍵因素是疫苗本身的質(zhì)量。目前普遍應(yīng)用的病毒疫苗主要分為弱毒（活）疫苗和滅活疫苗兩類。弱毒（活）疫苗分解成（弱毒疫苗、弱活疫苗）。近年來(lái)隨著分子病毒學(xué)研究的不斷深入，相繼研究出了（1）亞單位疫苗、（2）基因工程疫苗、（3）活載體疫苗、（4）分子疫苗。蟲(chóng)媒病毒是由媒介昆蟲(chóng)作為病毒的傳遞者的一類病毒，由蟲(chóng)媒病毒引起的疾病即為蟲(chóng)媒病毒，如乙型腦炎、新疆出血熱、登革熱、黑熱病等。類病毒沒(méi)有外殼蛋白，對(duì)各種有機(jī)溶劑有抵抗力，說(shuō)明也沒(méi)有脂質(zhì)外膜，只是一個(gè)裸露的RNA分子，類病毒只出現(xiàn)于植物。在人和動(dòng)物中存在著一類被稱為亞急性海綿樣腦病的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如瘋牛病。瘋牛病能夠通過(guò)食物鏈傳染給人。研究證明，這種奇特疾病的病原，即不是病毒，也不是類病毒，大體上是由蛋白質(zhì)組成，目前稱之為阮病毒。（總結(jié)：病毒亞急性海綿樣腦病的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如瘋牛?。┎≡瓕W(xué)：流行性乙型腦炎病毒屬于黃病毒科。黃病毒科能夠致人疾病的病毒有登革熱病毒、丙型肝炎病毒和乙型腦炎病毒。由于1924年乙型腦炎病毒首先證實(shí)于日本，故也稱其為日本乙型腦炎。C6/36細(xì)胞適合于乙型腦炎病毒的分離和培養(yǎng)。流行病學(xué)：（1）宿主動(dòng)物與傳染原：由蚊為媒介而傳播，引起人畜感染的主要媒介可能是三帶啄庫(kù)蚊，其他庫(kù)蚊也有可能。（2）傳染途徑：流行性乙型腦炎是一種自然疫源性疾病，豬是傳播乙型腦炎病毒（乙腦病毒）的主要?jiǎng)游锼拗鳌Ｒ倚湍X炎病毒通過(guò)蚊豬蚊的循環(huán)維持自身的存在。（3）人群易感性：除人、馬和豬外，通常不呈現(xiàn)臨床癥狀。