【文章內(nèi)容簡介】 性仍保留。病毒屬于微生物界，其不同于其他微生物的特性如下：病毒一般只含有一種核酸DNA或RNA，而其它微生物，包括細菌、支原體、衣原體、立克次體，則都同時含有兩種核酸。病毒通過基因組復(fù)制和表達產(chǎn)生子代病毒的核酸和蛋白質(zhì)，隨后裝配完整的病毒粒子。病毒缺乏完整的酶系統(tǒng)，不具備其他生物“產(chǎn)能”所需的遺傳信息，因此必須利用宿主細胞的酶類和產(chǎn)能機構(gòu)，并借助宿主細胞的生物合成機構(gòu)復(fù)制其核酸以及合成由其核酸編碼的蛋白質(zhì)，乃至直接利用細胞成分。某些RNA病毒的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成互補DNA（cDNA），與細胞基因組整合，并隨細胞DNA復(fù)制而增殖，即所謂的DNA前病毒。病毒沒有細胞壁，也不進行蛋白質(zhì)、糖和脂類的代謝活動，因此對于干擾微生物的這些代謝過程而影響微生物結(jié)構(gòu)和功能的抗生素，具有明顯的抵抗力。一個簡單的病毒粒子，實質(zhì)上只是一團遺傳物質(zhì)（DNA或RNA）和它外圍的一層蛋白外殼。這層蛋白外殼就是衣殼，衣殼和核酸一起總稱為核衣殼。病毒不含氨基酸，這是病毒與其他微生物，包括細菌、衣原體、立克次體等又一明顯區(qū)別。病毒的分類系統(tǒng)采用 目、科、亞科、屬和種的等級制度。屬名應(yīng)是一個以“virus”結(jié)尾的單詞；亞科“virinae”； 科“viridae”；目“virales” 結(jié)尾的單詞。動物病毒“種”的名稱大多引用其所引起疾病的名稱，后加“病毒”，獸醫(yī)學上則常再加上宿主（動物的名稱）種類，也有的在病名前再加最初發(fā)現(xiàn)該病毒的地名。毒珠名稱至少應(yīng)能反映該毒珠的分離地點和時間以及該毒珠的類別。根據(jù)其病毒核酸組成還可以將病毒分成DNA病毒和RNA病毒。RNA病毒可分為（1）正鏈RNA病毒；（2）負鏈RNA病毒，正鏈RNA病毒可以直接呈現(xiàn)mRNA的作用，同時又是合成互補鏈的模板； 一般情況下，正鏈RNA病毒的基因組RNA具有感染性。負鏈RNA病毒不能直接呈現(xiàn)mRNA的作用，即不能直接指導(dǎo)合成互補鏈。病毒缺乏自身增殖所需的完整酶系統(tǒng)，增殖時必須依靠宿主細胞合成核酸和蛋白質(zhì)，甚至直接利用宿主細胞的某些成分，這就決定了病毒在細胞內(nèi)專性寄生的特性。病毒的增殖過程大致可以分為：（1）吸附與侵入、（2）脫殼、（3）病毒成分的合成及裝配、（4）釋放等4個主要階段。病毒屬于微生物界，其不同于其他微生物的特性如下：病毒一般只含有一種核酸DNA或RNA，而其它微生物，包括細菌、支原體、衣原體、立克次體，則都同時含有兩種核酸。病毒通過基因組復(fù)制和表達產(chǎn)生子代病毒的核酸和蛋白質(zhì)，隨后裝配完整的病毒粒子。病毒缺乏完整的酶系統(tǒng)，不具備其他生物“產(chǎn)能”所需的遺傳信息，因此必須利用宿主細胞的酶類和產(chǎn)能機構(gòu)，并借助宿主細胞的生物合成機構(gòu)復(fù)制其核酸以及合成由其核酸編碼的蛋白質(zhì)，乃至直接利用細胞成分。某些RNA病毒的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成互補DNA（cDNA），與細胞基因組整合，并隨細胞DNA復(fù)制而增殖，即所謂的DNA前病毒。病毒沒有細胞壁，也不進行蛋白質(zhì)、糖和脂類的代謝活動，因此對于干擾微生物的這些代謝過程而影響微生物結(jié)構(gòu)和功能的抗生素，具有明顯的抵抗力。一個簡單的病毒粒子，實質(zhì)上只是一團遺傳物質(zhì)（DNA或RNA）和它外圍的一層蛋白外殼。這層蛋白外殼就是衣殼，衣殼和核酸一起總稱為核衣殼。病毒不含氨基酸，這是病毒與其他微生物，包括細菌、衣原體、立克次體等又一明顯區(qū)別。（1）實驗動物、（2）雞胚、（3）體外培養(yǎng)的器官、（4）細胞，這4種都可以作為人工增殖病毒的基本工具。而大量病毒的，又是病毒學實驗研究以及制備疫苗和特異性診斷試劑的先決條件。組織培養(yǎng)：病毒在細胞內(nèi)的增殖及其對細胞的作用，可以根據(jù)細胞病變、細胞培養(yǎng)物內(nèi)出現(xiàn)血凝素或其他病毒抗原、紅細胞吸附現(xiàn)象以及通過“指示病毒”的干擾等方法加以識別。組織培養(yǎng)用的玻璃器皿要用（硫酸、重鉻酸鉀）。常用于組織培養(yǎng)的人工綜合營養(yǎng)液的主要成分有：氨基酸、糖類、無機鹽、維生素、輔助生長因子等。常用的人工綜合營養(yǎng)液為：MEM和RPM1640。用人工綜合營養(yǎng)液配制細胞生長液時需要加入①適量血清和谷氨酰胺溶液，②還需要加入規(guī)定量的抗生素溶液防止細菌污染，③加入碳酸氫鈉溶液修正PH，④根據(jù)情況還可加入HEPES溶液可使生長液具有較強的PH緩沖能力。能使組織和成片細胞分散成單個細胞的化學制劑為胰蛋白酶和EDTA，EDTA使用液又可稱之為Versen溶液，其分散細胞的作用原理是EDTA可以結(jié)合鈣、鎂離子，使組織細胞分散。動物血清中具有細胞生長所必須的各種營養(yǎng)因子，它能促進細胞的貼壁和生長，且有很強的酸堿緩沖能力。細胞培養(yǎng)液在細胞培養(yǎng)過程中可分為（1）細胞生長液（2）細胞維持液兩種。細胞生長液：是使細胞發(fā)育增殖的液體，因此要求營養(yǎng)條件豐厚； 細胞維持液：用于延緩細胞代謝，從而延長細胞的存活時間，以利于實驗的進行。這兩種液體成分的主要區(qū)別是血清含量不同。細胞生長適宜的PH范圍是 PH ～。細胞培養(yǎng)技術(shù)全過程的關(guān)鍵是防止污染。細胞株的保存是組織培養(yǎng)中一個十分重要的工作，二甲基亞砜是細胞低溫保存的良好的保護劑，含10%二甲基亞砜的血清可以作為懸浮細胞的液體在液氮中保存細胞。病毒學上常用的細胞類型可分為（1）原代細胞、（2）二倍體細胞、（3）傳代細胞，三大類，原代細胞培養(yǎng)和傳代細胞培養(yǎng)的根本區(qū)別在于細胞是否能在體外無限傳代。細胞的純化：細胞的純化可以用細胞克隆技術(shù)。克隆是指用無性繁殖方法產(chǎn)生的一組遺傳上相同的細胞和生物群體的過程。病毒的分離和鑒定：（P219）病毒對細胞的感染性具有嚴格的選擇性和特異性，因此用組織培養(yǎng)細胞接種病毒必須首先選擇敏感細胞。（1）病毒增殖的判定：（略）（2）細胞病變（CPE）：大部分病毒在敏感細胞系均可出現(xiàn)CPE（細胞病變），CPE（細胞病變）可以表現(xiàn)為嚴重的細胞破壞、細胞腫大、顆粒增多、細胞融合成合胞體或無明顯的細胞變化等。CPE（細胞病變）經(jīng)常具有病毒“種”的特性，因此常常作為病毒堅定依據(jù)。（3）病毒蝕(shi)斑技術(shù)（又稱空斑）：病毒蝕(shi)斑是指病毒在已長成的單層細胞上形成的局限性病灶，主要用于病毒的純化或病毒懸液中感染病毒含量的測定。（用病毒蝕斑技術(shù)測定含量病毒純化或病毒懸液中感染的病毒）（4）病毒感染力的滴定：有兩種，一種方法是用實驗動物測定LD50(半數(shù)致死量)；另一種方法是在組織細胞上測定TCID50（半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量。（5）病毒的保存：分離或鑒定后的病毒經(jīng)過冷凍干燥后可以長期保存。免疫血清學實驗：免疫血清學實驗是利用抗原和抗體的特異性結(jié)合的原理進行的，主要用于兩個目的：①從病料獲得病毒株后，應(yīng)用已知的抗病毒血清或單克隆抗體進行免疫血清學試驗，鑒定病毒的種類乃至型別；②由發(fā)病動物采集血清標本，應(yīng)用全病毒或特異性病毒抗原，測定發(fā)病動物體液中的特異性抗體，或進一步比較發(fā)病動物的急性發(fā)病期和恢復(fù)期血清中的抗體效價，了解病毒性抗體是否有明顯的增長，從而判定病毒感染的存在。（1）中和試驗：動物在受到病毒感染后，在體內(nèi)產(chǎn)生抗體，如果該抗體能與相應(yīng)的病毒粒子特異性地結(jié)合，使后者喪失感染力，這種抗體就成為中和抗體。應(yīng)用已知的病毒或病毒抗原，可以測知患者體內(nèi)中和抗體的存在及其效價；用已知的抗病毒血清或中和性單克隆抗體，也可以進行病毒的鑒定，因此中和試驗也常用于新分離病毒株的鑒定。（2）血凝和血凝抑制試驗：許多病毒能夠凝集某些種類動物的紅細胞，病毒凝集的紅細胞種類隨病毒種類的不同而不同。血凝反應(yīng)可被特異性抗體所抑制，因此血凝抑制試驗可以應(yīng)用于：①應(yīng)用于標準病毒懸液測定血清中的相應(yīng)抗體；②應(yīng)用于特異性抗體鑒定新分離的病毒。用枸櫞酸鈉配置的阿氏液具有抗紅細胞凝集作用，用于血凝和血凝抑制試驗中配置紅細胞懸掖。同一患者急性發(fā)病期和恢復(fù)期雙份血清（相距2～3周）的抗體效價增高4倍以上者，說明本次發(fā)病是由所測抗體相應(yīng)病毒引起的。（3）補體結(jié)合試驗：一個抗體分子與抗原結(jié)合后，可以導(dǎo)致數(shù)百個補體分子的激活，呈現(xiàn)一定程度的放大作用，所以補體結(jié)合試驗是一個比較敏感的方法，一般用于人及動物血清中特異性抗體的定量檢測（補體結(jié)合試驗），也常用于新分離病毒的鑒定。（4）免疫熒光技術(shù)：將抗原或抗體標記上熒光素，再進行抗原抗體反應(yīng)，出現(xiàn)熒光就說明標記物的存在，同時也反映了抗原或抗體的存在。免疫熒光技術(shù)具有抗原抗體反應(yīng)的特異性和染色技術(shù)的快速性，并可在細胞水平上進行抗原定位，故在病毒學研究和病毒病的診斷中都是一種應(yīng)用很廣的方法。熒光抗體染色技術(shù)包括（1）直接法、（2）間接法、（3）補體法、（4）SPA(葡萄球菌A蛋白)免疫熒光法。（5）酶免疫技術(shù)：以酶作為標記物，通過化學方法將其與抗原或抗體共價結(jié)合，形成酶標記物，可與被檢的抗原或抗體起反應(yīng)，形成酶標記免疫復(fù)合物。制備酶結(jié)合物的方法很多，目前應(yīng)用最廣泛的有過碘酸鹽法和戊二醛法。酶免疫測定試驗包括：①間接法（測抗體）、②雙抗體夾心法（測抗原）、③IgM捕獲ELISA（酶鏈免疫吸附實驗）、④競爭法。IgM是動物機體在受到初次抗原刺激后最早產(chǎn)生的一種抗體球蛋白，因此IgM捕獲ELISA常應(yīng)用于多種病毒病的早期診斷?？箄鏈抗體特異性結(jié)合IgM，可以應(yīng)用于IgM捕獲ELISA。IgG是主要的抗病毒抗體，在第二次抗原刺激時，由于免疫回憶，發(fā)生迅速的加強反應(yīng)IgG量顯著增高（分子量大）。在病毒病的診斷中，也常將這一原理用于判斷病毒病的感染狀況，但常常需要采集恢復(fù)期和急性期雙份血清進行抗體效價的比較如IgG水平4倍或4倍以上增加具有血清學診斷意義。（6）膠體金免疫檢測技術(shù)：膠體金免疫檢測技術(shù)是以膠體金為載體吸附抗體和抗原，完成檢測特異性抗原或抗體的。膠體金免疫檢測技術(shù)優(yōu)于ELISA（酶鏈免疫吸附實驗）法和免疫熒光法的最主要一點是肉眼直接判定結(jié)果。（總結(jié)：膠體金免疫檢測技術(shù)就是直接用肉眼可以觀察結(jié)果）。病毒病的分子生物學診斷：分子生物學診斷的特異性取決于核酸序列的特異性，病毒病的分子生物學診斷，包括對病毒核酸和蛋白質(zhì)的測定。PCR（全稱是聚合酶鏈反應(yīng)），是在引物、摸板DNA和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。由于引物是按照與擴增區(qū)段兩端序列彼此互補的原則設(shè)計的，因此每一條新生鏈的合成都是從引物的退火結(jié)合位點開始，并沿著相反鏈延伸。因此，PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）的特異性是由人工合成的一對寡核苷酸引物所決定的。PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）可以在數(shù)小時內(nèi)對僅有的幾個拷貝的基因放大數(shù)百萬倍，使PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）擴增結(jié)果在瓊脂糖凝膠電泳后形成明顯可見的DNA帶。溴化乙錠（EB）可以插入核酸分子之間并在紫外線下放射熒光，因此可以作為核酸分子電泳的指示劑。（核酸分子電泳的指示劑用溴化乙錠EB）。（1）RTPCR(聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù)：由于DNA聚合酶不能以RNA為摸板合成cDNA，所以不能對RNA病毒核酸進行直接PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）。首先必須提取病毒RNA。提取病毒RNA時，要注意避免RNA酶對病毒RNA的降解作用。為此，所用的試劑和用品均需要進行無Rnase處理，（Rnas必須使用無熱原質(zhì)水制備）如加入RNA酶抑制劑或高壓滅菌。加入反轉(zhuǎn)錄酶經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成與病毒RNA互補的DNA(cDNA)，然后才能進行PCR（聚合酶鏈反應(yīng)），這就是所謂的RTPCR（逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)）。目前常用的逆轉(zhuǎn)錄酶（RTPCR）包括MMV和AMV。RTPCR（逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)）反應(yīng)的特異性取決于模板和引物，引物序列必須是被檢病毒特異的，原則上要求引物339。端堿基與模板一定要配對，對引物539。末端的堿基并沒有嚴格的限制，只要與模板DNA結(jié)合的引物長度足夠，其539。末端堿基可以不與模板DNA匹配而呈游離狀態(tài)，因此對引物539。末端可以進行自由修飾。PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）反應(yīng)中，引物1又稱Watson引物，是與模板正鏈互補的寡核苷酸鏈。（2）核酸雜交檢測技術(shù)：雜交的基本原理是帶互補序列的單鏈核苷酸相遇時，會退火形成雙鏈。“用于診斷目的”雜交雙方是已知序列的病毒探針和待測樣品中的病毒核酸，如果是陽性結(jié)果說明病毒感染的存在。在核酸分子雜交技術(shù)基礎(chǔ)之上又發(fā)展了一系列檢測DNA和RNA的技術(shù)，如Southrn blotting、Western blotting、Dit blotting和菌落雜交。聚丙烯酰胺凝膠電泳也可簡稱為PAGE（PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳測雜交）DNA限制性內(nèi)切酶可以識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列。利用不同的內(nèi)切酶切割病毒DNA，依據(jù)切割后的片段在凝膠電泳中泳動速率不同所形成的電泳帶型做出診斷。（3）病毒病的免疫預(yù)防：決定疫苗免疫效果的關(guān)鍵因素是疫苗本身的質(zhì)量。目前普遍應(yīng)用的病毒疫苗主要分為弱毒（活）疫苗和滅活疫苗兩類。弱毒（活）疫苗分解成（弱毒疫苗、弱活疫苗）。近年來隨著分子病毒學研究的不斷深入，相繼研究出了（1）亞單位疫苗、（2）基因工程疫苗、（3）活載體疫苗、（4）分子疫苗。蟲媒病毒是由媒介昆蟲作為病毒的傳遞者的一類病毒，由蟲媒病毒引起的疾病即為蟲媒病毒，如乙型腦炎、新疆出血熱、登革熱、黑熱病等。類病毒沒有外殼蛋白，對各種有機溶劑有抵抗力，說明也沒有脂質(zhì)外膜，只是一個裸露的RNA分子，類病毒只出現(xiàn)于植物。在人和動物中存在著一類被稱為亞急性海綿樣腦病的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如瘋牛病。瘋牛病能夠通過食物鏈傳染給人。研究證明，這種奇特疾病的病原，即不是病毒，也不是類病毒，大體上是由蛋白質(zhì)組成，目前稱之為阮病毒。（總結(jié)：病毒亞急性海綿樣腦病的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如瘋牛?。┎≡瓕W：流行性乙型腦炎病毒屬于黃病毒科。黃病毒科能夠致人疾病的病毒有登革熱病毒、丙型肝炎病毒和乙型腦炎病毒。由于1924年乙型腦炎病毒首先證實于日本，故也稱其為日本乙型腦炎。C6/36細胞適合于乙型腦炎病毒的分離和培養(yǎng)。流行病學：（1）宿主動物與傳染原：由蚊為媒介而傳播，引起人畜感染的主要媒介可能是三帶啄庫蚊，其他庫蚊也有可能。（2）傳染途徑：流行性乙型腦炎是一種自然疫源性疾病，豬是傳播乙型腦炎病毒（乙腦病毒）的主要動物宿主。乙型腦炎病毒通過蚊豬蚊的循環(huán)維持自身的存在。（3）人群易感性：除人、馬和豬外，通常不呈現(xiàn)臨床癥狀。