取小鼠腦組織(編輯修改稿)
2024-10-03 22:00 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 多久？抽提后的中RNA放80度冰箱會(huì)很容易降解么，還是說(shuō)要放液氮？Western blot方面：標(biāo)本用什么溶液灌注，溫度？同一個(gè)標(biāo)本可以同時(shí)用于RTPCR和Western blot檢測(cè)么？（如果灌注手段一樣的話）冰凍切片方面：灌注沖血用什么溶液，溫度？4%多聚甲醛灌注固定一般灌注多常時(shí)間？多少毫升？4%多聚甲醛后固定時(shí)間是多久為宜？蔗糖梯度脫水，蔗糖是用什么配置的，PBS還是PB，濃度是多大的？蔗糖梯度是15%到20%再30%么？在每種濃度里沉底后就換另一種還是？我試做過(guò)一次，做法為：常規(guī)多聚甲醛灌注固定后，再多聚甲醛后固定過(guò)夜，然后30%的蔗糖脫水，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蔗糖脫水3天了都還沒(méi)沉底（中間換過(guò)一次蔗糖溶液）。有戰(zhàn)友提議可以切幾塊后脫水效果會(huì)更好，如果你有跟我做一樣的模型標(biāo)本，你是怎么處理的，如何切？1還有什么需要注意的地方或tips。 灌注沖血用什么溶液，溫度？用的是含有肝素鈉的生理鹽水。每瓶500ml的生理鹽水加入80mg的肝素鈉，肝素鈉要避光保存，而且必須使用前臨時(shí)加入到生理鹽水中。肝素鈉生理鹽水需要用4度預(yù)冷。我們用注射器推，大概推100ml，10min。就可以將血液沖干凈。速度要自己掌握。每支肝素鈉每亳升含12500U，相當(dāng)于100mg，用20ml生理鹽水稀釋，分裝成40支，消毒備用（4℃貯存）。臨用時(shí)，注射器吸取肝素鈉溶液一支，而后將肝素液來(lái)回抽動(dòng)，使針筒局部濕潤(rùn)，多余肝素液全部排出棄之，注射器內(nèi)死腔殘留的肝素液即可抗凝。純的肝素10 mg能抗凝100 ml血液（按1mg等于100個(gè)國(guó)際單位，10個(gè)國(guó)際單位能抗凝1ml血液計(jì)）。如果肝素的純度不高，或過(guò)期，所用的劑量應(yīng)增大2～3倍。用于試管內(nèi)抗凝時(shí)，一般可配成1%肝素生理鹽水溶液，加熱80℃烘干，每管能使5～10 ml血液不凝固。作全身抗凝時(shí)，一般劑量為：～3 mg(200～300g體重)1,兔或貓10 mgkg1,狗5～10 mgkg1。如果肝素的純度不高，或過(guò)期，所用的劑量應(yīng)增大2～3倍。4%多聚甲醛灌注固定一般灌注多常時(shí)間？多少毫升？一般多聚甲醛灌注20min，100ml。標(biāo)準(zhǔn)是動(dòng)物的尾巴會(huì)甩動(dòng)，全身四肢收縮（這是因?yàn)榈鞍鬃冃运拢?，一般看起?lái)像動(dòng)物活過(guò)來(lái)了一樣。隨后就可以將動(dòng)物的頭斷掉，來(lái)取腦了。4%多聚甲醛后固定時(shí)間是多久為宜？這個(gè)不一定。對(duì)于石蠟切片，可以固定很久。但是對(duì)于冰凍切片，估計(jì)是隔夜或者24h。但是先固定一晚上后再取出來(lái)，將不需要的大腦組織切掉，比如腦干、小腦等等。擦干，放在蔗糖溶液里。蔗糖梯度脫水，蔗糖是用什么配置的，PBS還是PB，濃度是多大的？蔗糖梯度是15%到20%再30%么？在每種濃度里沉底后就
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