【文章內容簡介】 同完成。雄性生殖功能主要包括生精、保證性行為和調節(jié)生殖功能。睪丸為雄性的主要性器官，具有生精和內分泌功能。附睪是精子濃縮、成熟、貯藏和轉運的部位。在附睪內精子的形態(tài)和代謝都發(fā)生變化 ，變得成熟，并獲得運動和受精能力。然而附睪生殖功能的實現(xiàn)有取決于附睪上皮細胞的吸收和分泌。 睪丸是重要的內分泌器官，主要分泌雄激素和抑制素。 睪丸表面覆以睪丸被膜。睪丸被膜包括鞘膜臟層、白膜和血管膜 3層。白膜為致密堅硬的結締組織，在睪丸后緣增厚形成睪丸縱隔?？v隔的結締組織呈放射狀伸入睪丸實質把睪丸分隔為多個分隔間，形成小葉隔，分隔間充滿了彎曲的上皮性管道，稱為曲細精管。生精小管在近睪丸縱隔處變?yōu)槎潭钡闹本」埽本」苓M入睪丸縱隔相互吻合形成睪丸網。曲細精管周邊為一結締組織薄層，即基膜，由彈性纖維及一些平滑 肌細胞構成。生精上皮是曲細精管內的主要結構，它由支持細胞和各期生精細胞組成，附著于基膜之上。生精細胞包括精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、圓形精子細胞及長形精子細胞。它們依序由曲細精管的基底部向管腔排列。初級精母細胞經過第一次減數分裂形成次級精母細胞，體積比初級精母細胞小，細胞和細胞核均為圓形，核內染色質呈細網狀，著色較淺，細胞質少。次級精母細胞存在時間較短，很快進入第二次減數分裂，形成兩個精子細胞（圓形），染色體數目減半，成為單倍體細胞。由于次級精母細胞存在的時間短，在切片中較少見。精子細胞靠近管腔， 細胞質少，核圓形，染色較深，它不再分裂，經過復雜的形態(tài)演變后形成精子。支持細胞比生殖細胞大得多，而且形態(tài)復雜，成體的支持細胞不再分裂，它們支持著整個生精上皮，附著于生精上皮的基底層，并穿過生殖細胞間伸向管腔，為精子發(fā)生提供了一個合適的環(huán)境。每一個支持細胞支持的生精細胞數目相對恒定，支持細胞的總數對最終睪丸的重量及精子產量都有影響 [4]。 睪丸標志性酶的功能 精子的發(fā)生與成熟依賴于其生存內環(huán)境的穩(wěn)定、相關激素和酶類的調節(jié)。睪丸內的睪酮釋放后，被選擇性輸送到曲細精管中，與曲細精管 Sertoli細胞內的雄 激素受體及管腔中的雄激素結合蛋白結合，促使精子發(fā)生和成熟 [13]。 機體防御體系的抗氧化能力的強弱與健康程度存在著密切聯(lián)系，該防御體系有酶促與非酶促兩個體系，許多酶是以微量元素為活性中心，例如：超氧化物岐化酶（ SOD）、過氧化氫酶（ CAT）、谷胱甘肽 S轉移酶（ GST）等，非酶促反應體系中主要為維生素、氨基酸和金屬蛋白質。例如： VE、胡蘿卜素、 VC、半胱氨酸、乳鐵蛋白等。這個體系的防護氧化作用主要通過三條途徑：（ 1）消除自由基和活性 4 氧以免引發(fā)脂質過氧化：（ 2）分解過氧化物，阻斷過氧化鏈；（ 3）除去起催化作用 的金屬離子。防御體系各成分之間相互起到了協(xié)同作用，以及代償作用與依賴作用 [14]。 堿性磷酸酶（ AKP）是動物代謝過程中重要的調控酶， 能夠將對應 底物 去磷酸化 ，即通過水解 磷酸 單 酯 將底物分子上的磷酸基團除去，并生成磷酸根 離子和自由的 羥基 ，這類底物包括核酸 、蛋白、生物堿等。而該脫去磷酸基團的過程被稱為去磷酸化或脫磷酸化。 它是一種非特異性磷酸水解酶， 磷酸酶的作用與激酶 的作用正相反，激酶是 磷酸化 酶，可以利用能量分子，如 ATP，將磷酸基團加到對應底物分子上 [15]。 AKP能催化磷酸單脂的水解及磷酸基團的轉移反應，對動物的生存具有重要的意義 [16]。 本試驗的目的及意義 近十多年來，國內外對多種有機錫化合物對哺乳動物免疫系統(tǒng)的影響有很多研究 [17]。 Thayser(1984)最早報道有機錫化合物對哺乳動物免疫系統(tǒng)有抑制作用 [18]。Sherman等（ 1988）發(fā)現(xiàn)高劑量三丁基錫和二丁基錫化合物引起小鼠胸腺和脾臟萎縮，小鼠體重降低；低劑量 TBT對淋巴細胞功能也有抑制作用 [19]。 Annanie等（ 1988）報道 TBT對小鼠免疫系統(tǒng)的影響，并發(fā)現(xiàn)氯化二丁基錫影響最大 [20]。關于有機錫化合物對哺乳動物生殖系統(tǒng)影響的研究很少，只有 Alam等（ 1993）報道過 DBTL（二月桂酸二丁基錫）對大鼠繁殖的影響，而對哺乳動物精子影響未見報道 [21]。有資料表明，由于環(huán)境污染，人類的精子質量明顯下降 [22,23]。 但是對于環(huán)境水平下的 TPT含量對 雄性哺乳動物生殖的影響及機制還沒有比較全面的研究報道。 本試驗以青春期 SD 大鼠作為研究對象，采用低水平（ 、 50 μg/kg）的 TPT灌胃染毒，進行 54 d 的暴露， 稱量每只大鼠的體重、睪丸和附睪重量并計算睪丸指數和附睪指數，精子涂片觀察附睪內精子形態(tài)并計算畸形率，采用石蠟切片和 HE染色的方法觀察睪丸和附睪組織學變化，用分光光度法測定睪丸中堿性磷酸酶（ AKP）、總抗氧化能力（ TAOC）和 γ谷氨酰轉肽酶 （ γGT）水平 ；以初步探討TPT 對雄性大鼠生殖機能的影響及其生殖毒性的作用機理，為分析預測環(huán)境 TPT 污染對動物以及人類健康的影響提供依據。 2 材料與方法 實驗動物及分組處理 選健康的 SPF 級青春期 SD 大鼠 20 只 （ 鄭州大學試驗中心提供 ） ，隨機分 為 4組： 3 個不同劑量 (、 50 μg/kg)的處理組和對照組，每組 5 只。各 TPT 處理組均用配好的濃度液灌胃，對照組給予等量溶劑（生理鹽水和無水乙醇），每 3 日 1 5 次，暴露 54 d。末次染毒 24 h 后用 10%的水合氯醛麻醉動物，眼眶采血后處死，取雙側睪丸，稱重，分別進行睪丸的形態(tài)學觀察。將一側睪丸和附睪放入多聚甲醛固定液中固定，另一側睪丸和附睪放入 20℃冰箱中凍存用于標志性酶活性的測定。 試驗儀器與試劑 試驗試劑 ；蘇木精，分析純（ AR），購于成都市科龍化工試劑廠，批號： 20210725；伊紅，分析純（ AR），購于天津市津科精細化工研究所，批號： 20210727；二甲苯，分析純（ AR），購于煙臺市雙雙化工有限公司，批號： 20211116；無水乙醇，分析純（ AR），購于天津市凱通化學試劑有限公司，批號： 2021415；氯化鈉（ AR） ,購于天津市凱通化學試劑有限公司；磷酸氫二鈉（ AR） , 購于天津市凱通化學試劑有限公司 。磷酸氫二鈉（ AR），購于天津市凱通化學試劑有限公司；中性樹膠，購于上海標本模型廠，批號： 20210109；即用型 SABC 免疫組化染色試劑盒，購于武漢博士德生物工程有限公司 ；多聚賴氨酸，購于武漢博士德生物工程有限公司；雄激素受體，購于武漢博士德生物工程有限公司；其余試劑均為國產分析純試劑。 試驗儀器 2021 型手搖式組織切片機、 Olympus BH1 型顯微鏡、 MIE 顯微圖像處理軟件（購于山東易創(chuàng)電子有限公司）、 101 型電熱恒溫干燥箱、電子萬用爐，單孔二列電熱恒溫水浴鍋、電子天平、移液槍、烤片臺等。 檢測項目及方法 組織學結構觀察 石蠟切片制作： 取多聚甲醛固定的組織，修塊后流水沖洗過夜 —— 75%乙醇（ 2h） —— 80%乙醇（ 3 h） —— 90%乙醇（ 2 h） —— 95%乙醇 Ⅰ （ 1 h） —— 95%乙醇Ⅱ（ 1 h） —— 100%乙醇 Ⅰ （ 1 h） —— 100%乙醇 Ⅱ （ 30 min） —— 二甲苯（觀察透明效果） —— 蠟 Ⅰ （ 1 h） —— 蠟Ⅱ（ 30 min） —— 包埋。 HE 染色： 二甲苯 Ⅰ 種脫蠟 10 min—— 二甲苯Ⅱ中脫蠟 5 min—— 100%酒精 Ⅰ 中脫二甲苯5min—— 100%酒精Ⅱ中脫二甲苯 5 min—— 95%酒精中 5 min—— 85%酒精中 5 min—— 75%酒精中 5 min—— 蒸餾水中洗 3 min—— 蘇木素染色 5 min—— 流水沖洗5 min—— %鹽 酸分化 20~40 s—— 流水沖洗 5 min———— 流水沖洗 5~10 min—— 鏡檢著色滿意后放入蒸餾水清洗 —— 70%酒精 5 min—— 85%酒精 5 min—— 伊紅染色 2~3 min—— 95%酒精Ⅰ 5 min—— 95%酒精Ⅱ 5 min—— 100%酒精Ⅰ 中 10 min—— 100%酒精Ⅱ中 5 min—— 二甲苯 Ⅰ 中 10 min—— 二甲苯Ⅱ中 10 min—— 中性樹膠封片。 6 雄激素陽性灰度值測定 免疫組織化學： 1. 載玻片用多聚賴氨酸處理以防脫片。撈片后置烤箱 5860oC,3060min 以使切片 緊密粘附。 2. 切片常規(guī)脫蠟至水。 3. 3%的雙氧水室溫 510 分鐘以滅活內源性酶。蒸餾水洗 3 次。 4. 熱抗原修復：將切片浸入 枸櫞酸鹽緩沖液（ ），電爐加熱至沸騰后斷電，間隔 510 分鐘后，反復 12 次。冷卻后 PBS()洗滌 1— 2次。 5. 滴加 5%BSA 封閉液，室溫 20 分鐘。甩去多余液體，不洗。 6. 滴加稀釋 50 倍的一抗（小鼠 IgG）， 37oC 小時。 7. 滴加生物素化山羊抗小鼠 IgG, 2037oC 20 分鐘。 PBS()洗 2 分鐘 3 次 8. 滴加試劑 SABC， 2037Oc 20 分鐘。 PBS() 洗 5 分鐘 4 次。 9. DAB 顯色：使用 DAB 顯色試劑盒（ AR1022） .取 1ml 蒸餾水，加試劑盒中 A,B,C試劑各 1 滴，混勻后加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應時間，一般在 530分鐘之間。蒸餾水洗滌。 10. 蘇木精輕度復染。脫水，透明，封片。顯微鏡觀察。 統(tǒng)計學方法 應用 統(tǒng)計軟件處理數據，結果用平均值177。標準誤差（ Mean177。 .）表示。用單因素方差分析的方法進行統(tǒng)計學分析，組間數據的顯著性檢驗采用 Dun39。t法，以 α= 為檢驗水準。 3 結果 光鏡觀察結果 TPT 暴露后，低劑量組大鼠體重顯著高于對照組，中劑量組的體重低于于對照組，高劑量組體重高于對照組，但差異均不顯著（ P）；與對照組相比，睪丸和附睪重量均有所增加，但差異均不顯著（ P）（表 1） 。 睪丸指數和附睪指數與對照組相比，低劑量和中劑量組的睪丸指數較對照組大，高劑量組較對照組減小（圖1），附睪指數相比沒有明顯變化，統(tǒng)計學分析沒有顯著性差異（ P）（圖 2）。 表 1 TPT 暴露后 SD 大鼠體重、睪丸重和附睪重 的變化 (n=5) 7 體重（ g） 睪丸重（ g） 附睪重（ g） Control 177。 177。 177。 TPT μg/kg 177。 177。 177。 TPT 5 μg/kg 177。 177。 177。 TPT 50 μg/kg 177。 177。 177。 注：上標沒有相同字母的組間表示差異顯著（ P＜ ） 圖 1 TPT 暴露后 SD 大鼠睪丸指數的變化 (n=5) 上標沒有相同字母的組間表示差異顯著（ P＜ ） 圖 2 TPT 暴露后 SD 大鼠附睪指數的變化 (n=5) 上標沒有相同字母的組間表示差異顯著（ P＜ ） 地塞米松磷酸鈉處理后曲精小管直徑 變化 aaaa0control 5 50三苯基錫 ( μ g /k g )附睪指數（%）a a a a.0000.1000.2021.3000.4000.5000.6000