人類細(xì)胞質(zhì)rna提取rtpcr的原理方法瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應(yīng)用分析(編輯修改稿)
2024-10-03 10:43 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 dNTP Mixture〔各 10mM〕 2ul RNAase inhibitor (40U/ul) oligo (dT)18 1ul 逆轉(zhuǎn)錄酶 1ul 總 RNA ~1ug DEPC－ free水 補(bǔ)足體系至 20ul 第二十一頁，共四十九頁。 2024/9/25 〔 1〕兩步法 RTPCR 操作步驟 〔三〕 cNDA合成 b操作 在發(fā)給每人一份的已制備分裝的逆轉(zhuǎn)錄反響管里參加 8ul 總 RNA溶液 Ep管，迷你離心機(jī)離心數(shù)秒，放置 PCR儀中 42℃ 30min〔合成 cDNA第一鏈〕 85℃ 5min〔滅活逆轉(zhuǎn)錄酶〕 ↓ ↓ 第二十二頁，共四十九頁。 2024/9/25 〔 2〕一步法 RTPCR 操作步驟 〔三〕 cNDA合成 在一步法 RTPCR中，逆轉(zhuǎn)錄和 PCR在同時(shí)為逆轉(zhuǎn)錄和 PCR優(yōu)化的條件下，在同一管內(nèi)進(jìn)行。 優(yōu)勢(shì)：在處理大量樣品時(shí)易于操作；減少剩余污染；可以得到更高的靈敏度。 缺點(diǎn)：無法優(yōu)化反響條件；一旦失敗，必須重新提取總 RNA。 第二十三頁，共四十九頁。 2024/9/25 〔 2〕一步法 RTPCR 操作步驟 〔三〕 cNDA合成 總 RNA 200一 500 umol/L的 dNTP (每種 ) ／ L 基因特異引物 〔 上下游 〕 200 U AMV逆轉(zhuǎn)錄酶 1 Taq聚合酶緩沖液 ／ L MgCI2 1 mmo1／ L DTT Taq聚臺(tái)酶 終體積為 50ul。 第二十四頁，共四十九頁。 2024/9/25 〔 1〕 50ulPCR體系的組成〔即一步法〕： 操作步驟 〔四〕 PCR擴(kuò)增 第二十五頁，共四十九頁。 2024/9/25 〔 2〕 PCR反響過程： 操作步驟 〔四〕 PCR擴(kuò)增 第二十六頁，共四十九頁。 2024/9/25 〔 1〕引物退火溫度的調(diào)節(jié)，一般在引物設(shè)計(jì)軟件推薦溫度的上下 2 ℃ 變化尋找最佳答案退火溫度。 〔 2〕此外 Mg2＋ 濃度的調(diào)節(jié)也非常重要，通常最佳答案濃度為 2mM左 右。 〔 3〕引物和模板的量等。 操作步驟 〔五〕 PCR條件的優(yōu)化 第二十七頁，共四十九頁。 2024/9/25 根據(jù)產(chǎn)物長(zhǎng)度制作適宜濃度的瓊脂糖凝膠〔不同長(zhǎng)度產(chǎn)物所需凝膠濃度〕。 取適量 PCR產(chǎn)物，加上樣緩沖液充分混合，點(diǎn)樣于事先做好的瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中， 10V/cm電泳 45－ 60min。成像系統(tǒng)成像分析。 操作步驟 〔六〕 產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測(cè)定 第二十八頁，共四十九頁。 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應(yīng)用 第二十九頁，共四十九頁。 2024/9/25 實(shí)驗(yàn)原理 瓊脂糖為鏈狀多糖 →繩狀瓊脂糖束 →大網(wǎng)孔型凝膠 ——?jiǎng)e離、鑒定、純化 DNA 影響 DNA遷移率的因素： DNA分子的大小、構(gòu)象，凝膠濃度，電壓，電泳緩沖液的組成 pr incipe does matter 瓊脂糖濃度
外語相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1