【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 照品標(biāo)準(zhǔn)曲線性質(zhì)的不同，外標(biāo)法又分為外標(biāo)一點(diǎn)法和外標(biāo)兩點(diǎn)法。 若標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)原點(diǎn)，采用外標(biāo)一點(diǎn)法。 若標(biāo)準(zhǔn)曲線不通過(guò)原點(diǎn)，采用外標(biāo)兩點(diǎn)法。 外標(biāo)一點(diǎn)法的直線方程： C = F A F 為斜率 外標(biāo)兩點(diǎn)法的直線方程： 21 FAFC ?? 12121 AACCF???1221122 AACACAF???、 F1為斜率 F2為截距 （ 1）對(duì)照品溶液的制備 （ 2）供試品溶液的制備 （ 3）點(diǎn)樣 一般要求使用市售薄層板。 ①外標(biāo)一點(diǎn)法 ：至少 6個(gè)原點(diǎn) 對(duì)照品（ R） 2個(gè)（同一質(zhì)量）： 2R 供試品（ S） 4個(gè)（同一質(zhì)量）分 2組： 2S1 2S2 ② 外標(biāo)兩點(diǎn)法 ：至少 8個(gè)原點(diǎn) 對(duì)照品（ R） 4個(gè) 分 2組 大質(zhì)量的 2個(gè)： 2R1 小質(zhì)量的 2個(gè)： 2R2 供試品（ S） 4個(gè)（同一質(zhì)量）分 2組： 2S1 2S2 對(duì)照品與供試品應(yīng)交叉點(diǎn)加在同一塊薄層板上，目的在于消除各種誤差。測(cè)定時(shí)應(yīng)保證供試品原點(diǎn)的量在線性范圍內(nèi)，必要時(shí)可適當(dāng)調(diào)整供試品溶液的點(diǎn)樣量。 外標(biāo)兩點(diǎn)法 外標(biāo)一點(diǎn)法 （ 4）展開(kāi) （ 5）顯色定位 供試品色譜中待測(cè)斑點(diǎn)的比移值（ Rf值）和光譜掃描得到的吸收光譜最大吸收與最小吸收應(yīng)與對(duì)照品相符，以保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。 （ 6）掃描 應(yīng) 沿展開(kāi)方向 掃描， 不得橫向 掃描。 （ 7）含量計(jì)算 ①外標(biāo)一點(diǎn)法 ▲求出供試品被測(cè)成分（斑點(diǎn)）的質(zhì)量 Ms = MR X As AR Ms被測(cè)成分的質(zhì)量（ M n=2） MR被測(cè)對(duì)照品的質(zhì)量 As被測(cè)成分吸收度（熒光強(qiáng)度）積分值（ A n=2） AR被測(cè)對(duì)照品吸收度（熒光強(qiáng)度）積分值（ A n=2） __ _ _ ▲求出供試品中被測(cè)成分的含量 含量（ W/W） = Ms X 稀釋倍數(shù) 取樣量 含量（ W/片） = Ms X 稀釋倍數(shù) X 平均片重 取樣量 ②外標(biāo)兩點(diǎn)法 ▲求出供試品斑點(diǎn)中被測(cè)成分的質(zhì)量 Ms = ? C +V1C (V2V1) (AA1) (A2A1) Ms被測(cè)成分的質(zhì)量（ mg n=2） A1對(duì)照品小點(diǎn)樣量吸收度 V1對(duì)照品小點(diǎn)樣量（ μl） （熒光強(qiáng)度）積分值（ A n=2 ） V2對(duì)照品大點(diǎn)樣量（ μl ） A2對(duì)照品大點(diǎn)樣（熒光強(qiáng)度） A被測(cè)成分吸收度（熒光強(qiáng)度） 積分值（ A n=2） 積分值（ A n=2） C對(duì)照液的濃度（ mg/ml） __ 五、應(yīng)用實(shí)例 九分散是由馬錢(qián)子粉、麻黃、乳香和沒(méi)藥等制成。馬錢(qián)子粉中含有士的寧、番木鱉堿等生物堿，具生理活性但也有毒性，故需控制馬錢(qián)子含量。中國(guó)藥典規(guī)定按干燥品計(jì)每包含馬錢(qián)子以士的寧計(jì)應(yīng)為 ～ 。 供試品溶液的制備 取本品 10包，混合研勻。精密稱(chēng)取 2g臵具塞錐形瓶中，精密加氯仿 20ml與濃氨試液 1ml，輕輕搖勻，稱(chēng)重，于室溫下放臵24小時(shí)，再稱(chēng)重，補(bǔ)足氯仿減失的重量，充分振搖，濾過(guò)。精密量取濾液 10ml，用硫酸溶液（ 3→300 ）分次提取，至生物堿提盡，合并硫酸液，臵另一分液漏斗中，加濃氨試液使呈堿性，用氯仿分次提取，合并氯仿液，蒸干，放冷，殘?jiān)芯芗勇确?5ml使溶解，作為供試品溶液。 對(duì)照品溶液的制備 取士的寧對(duì)照品，加氯仿制成每 1ml含 ，作為對(duì)照品溶液。 測(cè)定法 吸取上述兩種溶液各 5μ l，分別點(diǎn)于同一硅膠 GF254薄層板上，以甲苯 丙酮 乙醇 濃氨試液。（ 16∶12∶1∶4 ）的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。照薄層色譜法進(jìn)行掃描，波長(zhǎng)： λ s=254nm ，λ R=325nm ，測(cè)量供試品吸收度積分值與對(duì)照品吸收度積分值，計(jì)算，即得。已知： AR＝ ， As＝ ，取樣量 。 解答問(wèn)題 ①采用外標(biāo)一點(diǎn)法還是外標(biāo)兩點(diǎn)法？ ②采用什么方法顯色定位？ ③計(jì)算每包藥品中馬錢(qián)子的含量。（保留兩位有效數(shù)字） ① 求出供試品斑點(diǎn)中士的寧的質(zhì)量 ② 求出供試品中士的寧的含量 Ms = MR X =5 μl x μg/ μl x = As AR 含量（ mg/包） = Ms X 稀釋倍數(shù) X 標(biāo)示重量 取樣量 = X 5ml X 20ml X = （ mg/包） 本品系由枳實(shí)、大黃和黃連等八味藥材制成的水丸。中國(guó)藥典規(guī)定按干燥品計(jì)算，每 1g含枳實(shí)以橙皮苷（ C28H34O15） 計(jì)，不得少于 。 供試品溶液的制備 取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約 ，精密稱(chēng)定（ ），臵索氏提取器中，加甲醇 90ml，加熱回流 4 小時(shí)，趁熱濾過(guò)至 100ml 量瓶中，用少量甲醇洗滌容器，洗液與濾液合并，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取 5ml ，臵 25ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取橙皮苷對(duì)照品，加甲醇制成每 1ml 含 ，作為對(duì)照品溶液。 測(cè)定法 精密吸取供試品溶液 5? 、對(duì)照品溶液 2 ? 與 5 ? ，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以甲醇為展開(kāi)劑，展開(kāi)，展距約 3cm ，取出，晾干，噴以 1％三氯化鋁的甲醇溶液，放臵 3 小時(shí)，在紫外光燈 (365nm) 下定位。上機(jī)進(jìn)行熒光掃描，激發(fā)波長(zhǎng)： 330nm ,線性掃描，測(cè)量供試品與對(duì)照品熒光強(qiáng)度的積分值（ AR(2 ? ) = AR (5 ? ) = AS=），計(jì)算，即得。 ★①聚酰胺 TLC分離黃酮類(lèi)成分效果較好故選之。 ②橙皮苷與 AlCl3反應(yīng)顯色，在 330nm紫外光下發(fā)射較強(qiáng)的綠色熒光（波長(zhǎng)： 500nm）。 回答問(wèn)題： ①本法采用的是吸收測(cè)定法還是熒光測(cè)定法？外標(biāo)一點(diǎn)法還是外標(biāo)兩點(diǎn)法？透射法還是反射法？直線掃描還是鋸齒掃描？光源是什么？ ②求算枳實(shí)（橙皮苷）的含量（保留三位有效數(shù)字），并判斷是否符合藥典規(guī)定。 (V2V1) (AA1) (A2A1) ①求算出斑點(diǎn)中橙皮苷的質(zhì)量 Ms = ? C +V1C = ? +2ul ? ( － ) (5ul－ 2ul) (－ ) =( X10 mg) ②求算出枳實(shí)（橙皮苷）在藥品中的含量 含量 （ mg/g） = Ms X 稀釋倍數(shù) 取樣量 = 5 X10 mg X X 10 ul X X 10 ul 5 5 5 5ul X 5 X 10 ul X 3 = 第五節(jié) 高效液相色譜法 （ High Performance Liquid Chromatograph HPLC） 一、定義 以高壓液體為流動(dòng)相的液相色譜分析法稱(chēng)為高效液相色譜法。