【文章內(nèi)容簡介】 照品標準曲線性質(zhì)的不同，外標法又分為外標一點法和外標兩點法。 若標準曲線通過原點，采用外標一點法。 若標準曲線不通過原點，采用外標兩點法。 外標一點法的直線方程： C = F A F 為斜率 外標兩點法的直線方程： 21 FAFC ?? 12121 AACCF???1221122 AACACAF???、 F1為斜率 F2為截距 （ 1）對照品溶液的制備 （ 2）供試品溶液的制備 （ 3）點樣 一般要求使用市售薄層板。 ①外標一點法 ：至少 6個原點 對照品（ R） 2個（同一質(zhì)量）： 2R 供試品（ S） 4個（同一質(zhì)量）分 2組： 2S1 2S2 ② 外標兩點法 ：至少 8個原點 對照品（ R） 4個 分 2組 大質(zhì)量的 2個： 2R1 小質(zhì)量的 2個： 2R2 供試品（ S） 4個（同一質(zhì)量）分 2組： 2S1 2S2 對照品與供試品應(yīng)交叉點加在同一塊薄層板上，目的在于消除各種誤差。測定時應(yīng)保證供試品原點的量在線性范圍內(nèi)，必要時可適當調(diào)整供試品溶液的點樣量。 外標兩點法 外標一點法 （ 4）展開 （ 5）顯色定位 供試品色譜中待測斑點的比移值（ Rf值）和光譜掃描得到的吸收光譜最大吸收與最小吸收應(yīng)與對照品相符，以保證測定結(jié)果的準確性。 （ 6）掃描 應(yīng) 沿展開方向 掃描， 不得橫向 掃描。 （ 7）含量計算 ①外標一點法 ▲求出供試品被測成分（斑點）的質(zhì)量 Ms = MR X As AR Ms被測成分的質(zhì)量（ M n=2） MR被測對照品的質(zhì)量 As被測成分吸收度（熒光強度）積分值（ A n=2） AR被測對照品吸收度（熒光強度）積分值（ A n=2） __ _ _ ▲求出供試品中被測成分的含量 含量（ W/W） = Ms X 稀釋倍數(shù) 取樣量 含量（ W/片） = Ms X 稀釋倍數(shù) X 平均片重 取樣量 ②外標兩點法 ▲求出供試品斑點中被測成分的質(zhì)量 Ms = ? C +V1C (V2V1) (AA1) (A2A1) Ms被測成分的質(zhì)量（ mg n=2） A1對照品小點樣量吸收度 V1對照品小點樣量（ μl） （熒光強度）積分值（ A n=2 ） V2對照品大點樣量（ μl ） A2對照品大點樣（熒光強度） A被測成分吸收度（熒光強度） 積分值（ A n=2） 積分值（ A n=2） C對照液的濃度（ mg/ml） __ 五、應(yīng)用實例 九分散是由馬錢子粉、麻黃、乳香和沒藥等制成。馬錢子粉中含有士的寧、番木鱉堿等生物堿，具生理活性但也有毒性，故需控制馬錢子含量。中國藥典規(guī)定按干燥品計每包含馬錢子以士的寧計應(yīng)為 ～ 。 供試品溶液的制備 取本品 10包，混合研勻。精密稱取 2g臵具塞錐形瓶中，精密加氯仿 20ml與濃氨試液 1ml，輕輕搖勻，稱重，于室溫下放臵24小時，再稱重，補足氯仿減失的重量，充分振搖，濾過。精密量取濾液 10ml，用硫酸溶液（ 3→300 ）分次提取，至生物堿提盡，合并硫酸液，臵另一分液漏斗中，加濃氨試液使呈堿性，用氯仿分次提取，合并氯仿液，蒸干，放冷，殘渣中精密加氯仿 5ml使溶解，作為供試品溶液。 對照品溶液的制備 取士的寧對照品，加氯仿制成每 1ml含 ，作為對照品溶液。 測定法 吸取上述兩種溶液各 5μ l，分別點于同一硅膠 GF254薄層板上，以甲苯 丙酮 乙醇 濃氨試液。（ 16∶12∶1∶4 ）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干。照薄層色譜法進行掃描，波長： λ s=254nm ，λ R=325nm ，測量供試品吸收度積分值與對照品吸收度積分值，計算，即得。已知： AR＝ ， As＝ ，取樣量 。 解答問題 ①采用外標一點法還是外標兩點法？ ②采用什么方法顯色定位？ ③計算每包藥品中馬錢子的含量。（保留兩位有效數(shù)字） ① 求出供試品斑點中士的寧的質(zhì)量 ② 求出供試品中士的寧的含量 Ms = MR X =5 μl x μg/ μl x = As AR 含量（ mg/包） = Ms X 稀釋倍數(shù) X 標示重量 取樣量 = X 5ml X 20ml X = （ mg/包） 本品系由枳實、大黃和黃連等八味藥材制成的水丸。中國藥典規(guī)定按干燥品計算，每 1g含枳實以橙皮苷（ C28H34O15） 計，不得少于 。 供試品溶液的制備 取本品粉末（過三號篩）約 ，精密稱定（ ），臵索氏提取器中，加甲醇 90ml，加熱回流 4 小時，趁熱濾過至 100ml 量瓶中，用少量甲醇洗滌容器，洗液與濾液合并，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取 5ml ，臵 25ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。 對照品溶液的制備 精密稱取橙皮苷對照品，加甲醇制成每 1ml 含 ，作為對照品溶液。 測定法 精密吸取供試品溶液 5? 、對照品溶液 2 ? 與 5 ? ，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以甲醇為展開劑，展開，展距約 3cm ，取出，晾干，噴以 1％三氯化鋁的甲醇溶液，放臵 3 小時，在紫外光燈 (365nm) 下定位。上機進行熒光掃描，激發(fā)波長： 330nm ,線性掃描，測量供試品與對照品熒光強度的積分值（ AR(2 ? ) = AR (5 ? ) = AS=），計算，即得。 ★①聚酰胺 TLC分離黃酮類成分效果較好故選之。 ②橙皮苷與 AlCl3反應(yīng)顯色，在 330nm紫外光下發(fā)射較強的綠色熒光（波長： 500nm）。 回答問題： ①本法采用的是吸收測定法還是熒光測定法？外標一點法還是外標兩點法？透射法還是反射法？直線掃描還是鋸齒掃描？光源是什么？ ②求算枳實（橙皮苷）的含量（保留三位有效數(shù)字），并判斷是否符合藥典規(guī)定。 (V2V1) (AA1) (A2A1) ①求算出斑點中橙皮苷的質(zhì)量 Ms = ? C +V1C = ? +2ul ? ( － ) (5ul－ 2ul) (－ ) =( X10 mg) ②求算出枳實（橙皮苷）在藥品中的含量 含量 （ mg/g） = Ms X 稀釋倍數(shù) 取樣量 = 5 X10 mg X X 10 ul X X 10 ul 5 5 5 5ul X 5 X 10 ul X 3 = 第五節(jié) 高效液相色譜法 （ High Performance Liquid Chromatograph HPLC） 一、定義 以高壓液體為流動相的液相色譜分析法稱為高效液相色譜法。