現(xiàn)代分子診斷技術(shù)詳述(編輯修改稿)
2025-03-22 14:47 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 無(wú)法區(qū)分是以前感染還是現(xiàn)在感染 3. DNA雜交診斷 例一： ? DNA的雜交探針是一段瘧原蟲(chóng)的高度重復(fù)的 DNA序列 ? 具體的分離過(guò)程： 1. 構(gòu)建一個(gè)瘧原蟲(chóng)的核基因文庫(kù) 2. 用標(biāo)記的瘧原蟲(chóng)核 DNA作探針去篩選核基因文庫(kù) 3. 選出那些雜交信號(hào)最強(qiáng)的克隆 4. 用這些選出來(lái)的片段作探針，與瘧原蟲(chóng)及其同屬中不導(dǎo)致瘧疾的種的核基因作雜交，以檢查該片段作為 DNA探針的可靠性 錐蟲(chóng)的檢測(cè) ? 錐蟲(chóng)在人體中可侵入肝、脾、淋巴結(jié)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在其中大量繁殖并殺死寄主細(xì)胞 ? 顯微鏡檢新鮮血液 ? 取新鮮血液感染未攜帶錐蟲(chóng)的寄生蟲(chóng) ,3040天后殺死昆蟲(chóng) ,鏡檢昆蟲(chóng)的腸道 ? 免疫檢測(cè) :假陽(yáng)性高 例二： ?PCR檢測(cè) ?針對(duì) 錐蟲(chóng)特有的一段 188bp的 DNA序列設(shè)計(jì)引物，特異地從錐蟲(chóng)基因組中擴(kuò)增得到188bp的條帶 二、細(xì)菌性傳染病及病毒性疾病的分子診斷技術(shù) ?抗生素的不合理使用 ?DNA雜交 ?PCR檢測(cè) ?噬菌體介導(dǎo) DNA雜交 ?設(shè)計(jì) 16SrRNA為探針 ?16SrRNA在細(xì)菌中拷貝數(shù)極高，高度的保守性 ?特異性不是很好 ?必須結(jié)合 PCR技術(shù) PCR檢測(cè) ?nested PCR ?針對(duì)目的病原菌的不同保守區(qū)段設(shè)計(jì)多對(duì)引物 每對(duì)引物都能特異的擴(kuò)增出一段目的片段，病原菌存在的可能性大大增加 模板 使用外引物，進(jìn)行第一次 PCR擴(kuò)增 使用內(nèi)引物，進(jìn)行第二次 PCR擴(kuò)增 第一次 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 第二次 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 巢式 PCR原理示意圖 ? PCR技術(shù)也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性 1. 新擴(kuò)增的目的 DNA特異性不強(qiáng) 2. 退火溫度過(guò)低 3. 模板中雜質(zhì)的污染 ? 假陰性 1. 存在 Taq酶的抑制劑 2. 模板量過(guò)少 3. 模板 DNA純度不夠 ? 原位 PCR(in situ PCR,ISPCR ) ? 在細(xì)胞或細(xì)胞切片上對(duì)待測(cè)的低拷貝數(shù)基因進(jìn)行擴(kuò)增，并通過(guò)原位雜交進(jìn)行檢測(cè) ? 不僅能檢測(cè)出病原微生物的存在，且能夠在組織細(xì)胞中定位 原位雜交 （ nucleic acid hybridization in situ） 將標(biāo)記探針與細(xì)胞或組織切片中的核酸進(jìn)行雜交，進(jìn)而檢測(cè)特異的 DNA或 RNA序列 細(xì)胞原位雜交 組織切片原位雜交 DNADNA RNADNA 三類(lèi)雜交 RNARNA 該法優(yōu)點(diǎn)： 不需提取核酸， 故可完整保持組織或細(xì)胞的形態(tài)，因而更能準(zhǔn)確地反映組織細(xì)胞的功能狀態(tài) 有 噬菌體介導(dǎo)細(xì)菌檢測(cè) ? 將熒光素酶基因引入到噬菌體的基因組，然后用轉(zhuǎn)基因噬菌體去侵染待測(cè)樣品 ? 噬菌體侵染該宿主菌，大量合成包括熒光素酶在內(nèi)的由噬菌體基因編碼的蛋白，向體系中加入熒光素和 ATP，就會(huì)有熒光產(chǎn)生 ? 結(jié)核菌的檢測(cè) ? 抗藥性菌株的檢測(cè) 熒光素酶 熒光素＋ ATP 熒光 利用宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、翻譯 噬菌體基因 熒光素酶基因 宿主細(xì)菌 噬菌體介導(dǎo)的細(xì)菌檢測(cè) 第三節(jié) DNA指紋 ?每個(gè)人體細(xì)胞內(nèi)都含有 23對(duì)染色體，每條染色體中部含有一個(gè)DNA分子， DNA分子中的核苷酸序列包含著遺傳信息，在 DNA分子中存在三種類(lèi)型：?jiǎn)慰截愋蛄?、中等程度重?fù)序列、高度重復(fù)序 ? 每個(gè)重復(fù)序列在 300個(gè)核苷酸長(zhǎng)度之內(nèi)，由于高度重復(fù)，序列經(jīng)過(guò)超離心后以衛(wèi)星帶出現(xiàn)在主要 DNA帶的附近，所以也稱(chēng)衛(wèi)星 DNA，其中的重復(fù)序列單元?jiǎng)t稱(chēng)為“小衛(wèi)星 DNA” ? “小衛(wèi)星”具有高度的可變性，但在“小衛(wèi)星 DNA “ 中有一小段序列則在所有個(gè)體中都一樣，稱(chēng)為“核心序列”。如果把核心序列串聯(lián)起來(lái)作為分子探針與不同個(gè)體的 DNA進(jìn)行分子雜交，就會(huì)出現(xiàn)各自特有的雜交圖譜。它們與人的指紋一樣具有專(zhuān)一性和特異性，因此稱(chēng)作“ DNA指紋” ? 通過(guò)對(duì)人類(lèi)基因組的解析，發(fā)現(xiàn)人與人之間 99． 99％的堿基序列都相同，而剩下的 %的堿基特征序列則來(lái)自于雙親，據(jù)此可用于“親子鑒定” 所羅門(mén)的審判： 大家都聽(tīng)說(shuō)過(guò)所羅門(mén)的審判這樣一件故事： 兩位婦人都聲稱(chēng)自己是孩子的母親，于是 所羅門(mén)就命令一名侍衛(wèi)把那個(gè)孩子帶來(lái)，要用劍將其 辟成兩半分給他們兩， 結(jié)果假母親同意所羅 門(mén)的判決，而孩子真 正的母親卻懇求侍衛(wèi) 饒了孩子的性命，她 解釋說(shuō)：“把孩子給了 假母親，總比讓孩子 慘死好?！碑?dāng)然，真假母親也就水落石出了 。 滴骨驗(yàn)親法： 以生者的血滴在尸骨上，觀察血能否浸入骨內(nèi)，浸入的則被認(rèn)為兩者有血緣關(guān)系，在各種古籍中有多種記錄。 三國(guó)時(shí)代（公園 220— 280年）謝承著 《 會(huì)稽先賢傳 》 中的 《 以弟血滴兄骨 》 可能是記錄此法的最早的史料：陳業(yè)的哥哥因海難不幸殞命，當(dāng)時(shí)一同遇難的有五六十人，并且尸體都已嚴(yán)重腐敗而無(wú)法辨認(rèn)死者的身份。陳業(yè)就用刀刺破自己的手臂將血分別滴在尸骨上，發(fā)現(xiàn)其血液只能浸入一具尸骨，其余皆不能。陳業(yè)就這樣確認(rèn)其兄的尸骨。 合血法： 等到了明代，更是采用了“合血法”來(lái)識(shí)別親權(quán)。明末清初的檢驗(yàn)書(shū)籍中都有相同的記載：“親子兄弟或自幼分離，欲相認(rèn)識(shí)。難辨真?zhèn)?。命各刺出血，滴一器?nèi)，真則共凝為一，否則不凝也?！? 方法： ?DNA指紋是指對(duì)待測(cè)樣品中的 DNA進(jìn)行分析所得到的具有特征性的 DNA分子雜交圖譜 ?DNA 酶解 電泳 轉(zhuǎn)膜 雜交 ?最常用的 DNA探針是微衛(wèi)星序列 受害者血樣 犯罪嫌疑人衣物上血樣 犯罪嫌疑人血樣 第四節(jié) 遺傳性疾病的分子診斷技術(shù) ? 直接診斷 ? 點(diǎn)突變 ? 間接診斷 ? 多態(tài)性連鎖分析 美國(guó)前副總統(tǒng)漢弗萊 Humphrey) 在 1967年發(fā)現(xiàn)膀胱內(nèi)有一腫物，病理切片未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞 良性“ 慢性增生性囊腫 ”，未進(jìn)行手術(shù)治療。 九年后，他被診斷為患有“ 膀朧癌 ” ，兩年后死于該病。 1994年，研究者用靈敏的 PCR技術(shù)對(duì)上述漢弗萊 1967年的病理切片進(jìn)行了 P53抑癌基因檢查，發(fā)現(xiàn)那時(shí)的組織細(xì)胞雖然在形態(tài)上
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1