現(xiàn)代分子診斷技術(shù)詳述(編輯修改稿)
2025-03-22 14:47 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 無法區(qū)分是以前感染還是現(xiàn)在感染 3. DNA雜交診斷 例一： ? DNA的雜交探針是一段瘧原蟲的高度重復(fù)的 DNA序列 ? 具體的分離過程： 1. 構(gòu)建一個(gè)瘧原蟲的核基因文庫 2. 用標(biāo)記的瘧原蟲核 DNA作探針去篩選核基因文庫 3. 選出那些雜交信號最強(qiáng)的克隆 4. 用這些選出來的片段作探針，與瘧原蟲及其同屬中不導(dǎo)致瘧疾的種的核基因作雜交，以檢查該片段作為 DNA探針的可靠性 錐蟲的檢測 ? 錐蟲在人體中可侵入肝、脾、淋巴結(jié)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在其中大量繁殖并殺死寄主細(xì)胞 ? 顯微鏡檢新鮮血液 ? 取新鮮血液感染未攜帶錐蟲的寄生蟲 ,3040天后殺死昆蟲 ,鏡檢昆蟲的腸道 ? 免疫檢測 :假陽性高 例二： ?PCR檢測 ?針對 錐蟲特有的一段 188bp的 DNA序列設(shè)計(jì)引物，特異地從錐蟲基因組中擴(kuò)增得到188bp的條帶 二、細(xì)菌性傳染病及病毒性疾病的分子診斷技術(shù) ?抗生素的不合理使用 ?DNA雜交 ?PCR檢測 ?噬菌體介導(dǎo) DNA雜交 ?設(shè)計(jì) 16SrRNA為探針 ?16SrRNA在細(xì)菌中拷貝數(shù)極高，高度的保守性 ?特異性不是很好 ?必須結(jié)合 PCR技術(shù) PCR檢測 ?nested PCR ?針對目的病原菌的不同保守區(qū)段設(shè)計(jì)多對引物 每對引物都能特異的擴(kuò)增出一段目的片段，病原菌存在的可能性大大增加 模板 使用外引物，進(jìn)行第一次 PCR擴(kuò)增 使用內(nèi)引物，進(jìn)行第二次 PCR擴(kuò)增 第一次 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 第二次 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 巢式 PCR原理示意圖 ? PCR技術(shù)也會產(chǎn)生假陽性 1. 新擴(kuò)增的目的 DNA特異性不強(qiáng) 2. 退火溫度過低 3. 模板中雜質(zhì)的污染 ? 假陰性 1. 存在 Taq酶的抑制劑 2. 模板量過少 3. 模板 DNA純度不夠 ? 原位 PCR(in situ PCR,ISPCR ) ? 在細(xì)胞或細(xì)胞切片上對待測的低拷貝數(shù)基因進(jìn)行擴(kuò)增，并通過原位雜交進(jìn)行檢測 ? 不僅能檢測出病原微生物的存在，且能夠在組織細(xì)胞中定位 原位雜交 （ nucleic acid hybridization in situ） 將標(biāo)記探針與細(xì)胞或組織切片中的核酸進(jìn)行雜交，進(jìn)而檢測特異的 DNA或 RNA序列 細(xì)胞原位雜交 組織切片原位雜交 DNADNA RNADNA 三類雜交 RNARNA 該法優(yōu)點(diǎn)： 不需提取核酸， 故可完整保持組織或細(xì)胞的形態(tài)，因而更能準(zhǔn)確地反映組織細(xì)胞的功能狀態(tài) 有 噬菌體介導(dǎo)細(xì)菌檢測 ? 將熒光素酶基因引入到噬菌體的基因組，然后用轉(zhuǎn)基因噬菌體去侵染待測樣品 ? 噬菌體侵染該宿主菌，大量合成包括熒光素酶在內(nèi)的由噬菌體基因編碼的蛋白，向體系中加入熒光素和 ATP，就會有熒光產(chǎn)生 ? 結(jié)核菌的檢測 ? 抗藥性菌株的檢測 熒光素酶 熒光素＋ ATP 熒光 利用宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、翻譯 噬菌體基因 熒光素酶基因 宿主細(xì)菌 噬菌體介導(dǎo)的細(xì)菌檢測 第三節(jié) DNA指紋 ?每個(gè)人體細(xì)胞內(nèi)都含有 23對染色體，每條染色體中部含有一個(gè)DNA分子， DNA分子中的核苷酸序列包含著遺傳信息，在 DNA分子中存在三種類型：單拷貝序列、中等程度重復(fù)序列、高度重復(fù)序 ? 每個(gè)重復(fù)序列在 300個(gè)核苷酸長度之內(nèi)，由于高度重復(fù)，序列經(jīng)過超離心后以衛(wèi)星帶出現(xiàn)在主要 DNA帶的附近，所以也稱衛(wèi)星 DNA，其中的重復(fù)序列單元?jiǎng)t稱為“小衛(wèi)星 DNA” ? “小衛(wèi)星”具有高度的可變性，但在“小衛(wèi)星 DNA “ 中有一小段序列則在所有個(gè)體中都一樣，稱為“核心序列”。如果把核心序列串聯(lián)起來作為分子探針與不同個(gè)體的 DNA進(jìn)行分子雜交，就會出現(xiàn)各自特有的雜交圖譜。它們與人的指紋一樣具有專一性和特異性，因此稱作“ DNA指紋” ? 通過對人類基因組的解析，發(fā)現(xiàn)人與人之間 99． 99％的堿基序列都相同，而剩下的 %的堿基特征序列則來自于雙親，據(jù)此可用于“親子鑒定” 所羅門的審判： 大家都聽說過所羅門的審判這樣一件故事： 兩位婦人都聲稱自己是孩子的母親，于是 所羅門就命令一名侍衛(wèi)把那個(gè)孩子帶來，要用劍將其 辟成兩半分給他們兩， 結(jié)果假母親同意所羅 門的判決，而孩子真 正的母親卻懇求侍衛(wèi) 饒了孩子的性命，她 解釋說：“把孩子給了 假母親，總比讓孩子 慘死好?！碑?dāng)然，真假母親也就水落石出了 。 滴骨驗(yàn)親法： 以生者的血滴在尸骨上，觀察血能否浸入骨內(nèi)，浸入的則被認(rèn)為兩者有血緣關(guān)系，在各種古籍中有多種記錄。 三國時(shí)代（公園 220— 280年）謝承著 《 會稽先賢傳 》 中的 《 以弟血滴兄骨 》 可能是記錄此法的最早的史料：陳業(yè)的哥哥因海難不幸殞命，當(dāng)時(shí)一同遇難的有五六十人，并且尸體都已嚴(yán)重腐敗而無法辨認(rèn)死者的身份。陳業(yè)就用刀刺破自己的手臂將血分別滴在尸骨上，發(fā)現(xiàn)其血液只能浸入一具尸骨，其余皆不能。陳業(yè)就這樣確認(rèn)其兄的尸骨。 合血法： 等到了明代，更是采用了“合血法”來識別親權(quán)。明末清初的檢驗(yàn)書籍中都有相同的記載：“親子兄弟或自幼分離，欲相認(rèn)識。難辨真?zhèn)?。命各刺出血，滴一器?nèi)，真則共凝為一，否則不凝也?！? 方法： ?DNA指紋是指對待測樣品中的 DNA進(jìn)行分析所得到的具有特征性的 DNA分子雜交圖譜 ?DNA 酶解 電泳 轉(zhuǎn)膜 雜交 ?最常用的 DNA探針是微衛(wèi)星序列 受害者血樣 犯罪嫌疑人衣物上血樣 犯罪嫌疑人血樣 第四節(jié) 遺傳性疾病的分子診斷技術(shù) ? 直接診斷 ? 點(diǎn)突變 ? 間接診斷 ? 多態(tài)性連鎖分析 美國前副總統(tǒng)漢弗萊 Humphrey) 在 1967年發(fā)現(xiàn)膀胱內(nèi)有一腫物，病理切片未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞 良性“ 慢性增生性囊腫 ”，未進(jìn)行手術(shù)治療。 九年后，他被診斷為患有“ 膀朧癌 ” ，兩年后死于該病。 1994年，研究者用靈敏的 PCR技術(shù)對上述漢弗萊 1967年的病理切片進(jìn)行了 P53抑癌基因檢查，發(fā)現(xiàn)那時(shí)的組織細(xì)胞雖然在形態(tài)上
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