河南科技大學(xué)大學(xué)生研究訓(xùn)練計(jì)劃(srtp)項(xiàng)目申請(qǐng)書-rn(編輯修改稿)
2025-03-22 14:31 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 μmol/L TaqDNA聚合酶應(yīng)控制在 四種 dNTP的濃度應(yīng)相等 Mg離子的濃度應(yīng)控制在 配置成相應(yīng)的 PCR反應(yīng)液。 然后放入 PCR儀中擴(kuò)增，最后將克隆的基因序列保存起來。 ? 制膠 ? 配制 2%凝膠 100ml： ? 稱取瓊脂糖 2g于三角瓶中，加入 100ml TBE（四溴乙烷）液，微波爐加熱 25min， 使瓊脂糖完全溶解（注意不要暴沸），置室溫等溫度下降至 60℃ 時(shí)，加入終濃度 （溴化乙錠）液，充分混勻后倒板（注意排除氣體）。 ⒉加樣和電泳 取 PCR反應(yīng)液 5~10μl， 加入 3μl溴酚蘭液，充分混勻，加入凝膠加樣孔中。電泳儀可用一般穩(wěn)壓可調(diào)中壓電泳儀，電泳工作液為 TBE液，接通電源，使樣品由負(fù)極向正極移動(dòng)。 60100V恒壓電泳約 3060分鐘。 ⒊ 結(jié)果檢測(cè) 將凝膠板放在紫外透射儀的石英玻璃臺(tái)上迚行檢測(cè)， DNA產(chǎn)物與熒光染料 EB形成橙黃色熒光復(fù)合物。觀察各泳道是否有橙黃色熒光帶出現(xiàn)，幵與擴(kuò)增時(shí)所設(shè)的陽性對(duì)照比較，判斷陽性或陰性結(jié)果。也可在電泳時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)分子量作對(duì)照，判斷其擴(kuò)增片段是否與設(shè)計(jì)的大小相一致。 ?利用提純?cè)噭┖袑?duì) PCR產(chǎn)物迚行提純 質(zhì)粒重組 ?由于要構(gòu)建 RNAi重組質(zhì)粒，故要選擇含有多個(gè)特殊酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒。 ?有紅眼標(biāo)記基因 ? 為了防止發(fā)生自連，提高連接效率，單酶切后，需要進(jìn)行去磷酸化。 ? 去磷酸方法如下： ? 1）微量離心管中加入下列反應(yīng)液，定容至 50μ l: ? 質(zhì)粒 DNA片段 120 pmol ? 10 Alkaline Phosphatase buffer 5μ l ? CIAP(1030U/μ l) 2μ l ? 無菌水 至 50μ l ? 2） 50℃ 反應(yīng) 30min； ? 3）酚 /氯仿 /異戊醇（ 25： 24： 1）抽提 2次，氯仿 /異戊醇（ 24：1）抽提 1次； ? 4）加 3M NaAc， ， 20℃ 下 30min60min； ? 5） 12023rpm 離 心 10min，棄上清液，沉淀用 70%冷乙醇 200μ l洗滌一次，晾干； ? 6） 10μ l TE buffer 溶解沉淀。 ? 質(zhì)粒及目的基因酶切位點(diǎn)的暴露 ? 反應(yīng)體系： ? 第一次： A： SpeI B:AvrII ? 第二次： A： XheI B:XbaI ? 反 應(yīng)條件： 溫度 37℃ ，酶切 ? 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果 ? 紫外線投射儀觀察結(jié)果 ? UVP凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié) 果 A 1μL B 1μL 10 H Buffer 2μL PwizDNA 10μL～ 12μL≤1μg 無菌水 6μL ～ 4μL 總體積 20μL（無菌水補(bǔ)至總體積） 質(zhì)粒及目的基因的連接 將 SpeI 內(nèi)切酶、 AvrII內(nèi)切酶、質(zhì)粒放入試管 1 將 SpeI 內(nèi)切酶、 AvrII內(nèi)切酶目的基因放入試管 2. 在 37攝氏度的條件下，酶切 。 將上述兩管雙酶切產(chǎn)物經(jīng)過純化，在 T4 DNA 連接酶作用下 16℃ 連接過夜。 同理將 NheI內(nèi)切酶及 XbaI內(nèi)切酶以同樣方法處理質(zhì)粒及目的基因幵將酶切產(chǎn)物連接。 ? 在無菌 Eppendorf管中加入以下溶液： ? 1) 10μl體積反應(yīng)體系中：取載體 50100ng，加入一定比例的外源 DNA 分子（一般線性載體 DNA分子與外源 DNA分子摩爾數(shù)為1∶1 1∶5 ），補(bǔ)足 ddH2O 至 8μl。 ? 2) 輕輕混勻，稍加離心，于 45℃ 水?。捣昼娛怪匦峦嘶鸬恼扯私怄湥? 迅速將混合物轉(zhuǎn)入冰浴。 ? 3) 加入含 ATP的 10Buffer 1μl， T4 DNA連接酶合適單位， 用 ddH2O 補(bǔ)至 10μl。 ? 蓋上管蓋，充分混勻，臺(tái)式離心扣上離心５秒。 ? １２ ℃ 下過夜連接反應(yīng)。 ? 反應(yīng)結(jié)束后于－２０ ℃ 保存。 ? tips： 連接反應(yīng)的溫度：ＤＮＡ連接酶的最適反應(yīng)溫度為３７ ℃ ，但在此溫度下， 粘性末端的氫鍵結(jié)合很不穩(wěn)定，折衷方法是１２ ℃ 過夜。 ?實(shí) 驗(yàn) 原 理 ? 把外源 DNA分子導(dǎo)入到某一宿主
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