雙向電泳的技術流程和樣品制備(編輯修改稿)
2025-03-22 13:26 本頁面
【文章內容簡介】 /W）。 特殊樣品的制備 低豐度蛋白的分離： 盡管增加上樣量和提高總蛋白的溶解度能增加分離時的低豐度蛋白的量 ， 但同時增加了高豐度蛋白的負荷 ， 且造成蛋白的疊加效應而影響分離 。 現(xiàn)常用預分級＋窄 pH膠的微制備技術進行分離：即將總蛋白組分成蛋白質組亞群 ， 再用 pH梯度小于 2個 pH單位的IPG膠進行窄 pH范圍的分離 。 ?強堿性蛋白質（如核糖體 ）的處理：先將蛋白預處理以富集，再用特殊 pH梯度的 IPG膠條（如 pH3－ 1412或 1012）進行等電聚焦。其中窄范圍堿性 IPG膠（如 pH1012）的挑戰(zhàn)是克服反向、陰極向陽極、電滲流和水平條紋模式，而寬范圍的堿性 IPG膠（如pH31 412）等消除了窄范圍膠所需要的專門水化液。 ?極端分子量的蛋白質： 小于 8kD和大于 200kD的蛋白在常規(guī) IPG2D上不易看到，這可能是在 Tris/glycine緩沖液中，樣品和游離的 dodelcyl sulfate ions持續(xù)積累濃縮，與小分子量的蛋白質發(fā)生對流混合，產(chǎn)生茸毛狀的或模糊的帶，從而降低小蛋白的分辨率；在膠底端，高濃度的十二磺酸使蛋白固定致染色困難。至于高分子量蛋白少的原因可能是在變性條件下，蛋白質復合物變成了多肽，或者可能是大分子。 一維固相 pH梯度等電聚焦（ IEF with IPG）： ? IPG膠的材料是 Immobilines，為擁有 CH2=CHCONHR結構的 8種丙烯酰胺衍生物系列，其中 R包含羧基或叔氨基團，它們構成了分布在pH3~10不同值的緩沖體系。根據(jù)公布的配方計算后，將適宜的 IPG試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中緩沖基團通過乙烯鍵共價聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成 pH梯度。通過這種方式生成的 IPG不會發(fā)生電滲透作用，因而可以進行特別穩(wěn)定的 IEF分離達到真正的平衡狀態(tài)。 IPG膠條的重泡脹 ?泡脹的實質：是讓樣品能完全以可溶性的形式進入 IPG內，從而能進行接下來的 IEF。 ?不同的加樣方法和加樣量會導致最終結果的差異： ? Protean IEF cell、 IPGphor等集成設備的使用： ? 20mmol/L DTT 墊片的使用： ?溫度的選擇： 蛋白載樣量 影響 IPG膠條對蛋白載樣量的因素包括： ? 待分析的蛋白點的量應滿足隨后的質譜分析。 ? 電泳的目的：如果只是得到一張好的圖片，則無需考慮太多其它因素。 ? 待研究蛋白的豐度： ? 樣品的復雜度：復雜度較高的樣品，為了盡可能的了解所包含的每種蛋白，需要反復實驗才能完成。如果將待檢樣品被富集以后則更易分析。 ? IPG膠條的 pH范圍： IPG膠條的蛋白質大約載樣量 IPG Strip length Analytical Load (silver staining) Preparative Load (Coom staining) 7cm 10~100 ? g /125 ? l 200~500ug/125 ? l 11cm 50~200 ? g /185 ? l 250~1000ug/185 ? l 17cm 100~300 ? g/300 ? l 1~3mg/300 ? l IPG IEF 中 pH梯度的選擇 ?常用方法：先寬后窄，先線性后非線性，先短后長，預試驗確定。 預分步收集 細胞漿 細胞核 細胞膜 核糖體及其他特定細胞成份 細胞分泌成份 pH412 pH310 pH47 pH58 pH710 pH611 pH36 pH34 pH45 pH56 pH67 pH78 pH89 pH910 pH1011 pH1112 第一步 第二步 第三步 用窄 pH范圍陣列分離低豐度或交叉覆蓋蛋白 陣列那些亞細胞定位位置的功能蛋白質 亞蛋白質組陣列策略的框架圖 3倍 3倍 聚焦時間的優(yōu)化 ? 理論上講，要獲得最好的圖譜質量和重復
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