抗體工程概述(編輯修改稿)
2025-03-19 11:36 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 每組片段分別退火，然后逐組連接成完整的可變區(qū)基因，插入質(zhì)粒中，然后逐組連接成完整的可變區(qū)基因，插入質(zhì)粒中，進(jìn)一步即可用于構(gòu)建和表達(dá)改形抗體。，進(jìn)一步即可用于構(gòu)建和表達(dá)改形抗體。 定點(diǎn)突變法定點(diǎn)突變法 是將人的可變區(qū)基因克隆，根據(jù)鼠抗是將人的可變區(qū)基因克隆，根據(jù)鼠抗體的體的 CDR 序列合成幾種突變引物，用定點(diǎn)突變的方序列合成幾種突變引物，用定點(diǎn)突變的方法將人的可變區(qū)基因的法將人的可變區(qū)基因的 CDR序列變?yōu)槭罂贵w的序列變?yōu)槭罂贵w的 CDR序序列，然后表達(dá)出改型抗體。列，然后表達(dá)出改型抗體。 研究表明，在構(gòu)建改形抗體時(shí)，簡(jiǎn)單地進(jìn)行研究表明，在構(gòu)建改形抗體時(shí)，簡(jiǎn)單地進(jìn)行 CDR替換并不能保證抗體具有好的親和力，因此在構(gòu)建替換并不能保證抗體具有好的親和力，因此在構(gòu)建時(shí)還必需包括時(shí)還必需包括 對(duì)影響抗原結(jié)合位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)的框?qū)τ绊懣乖Y(jié)合位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)的框架序列架序列 進(jìn)行操作。進(jìn)行操作。 小分子抗體包括小分子抗體包括 Fab、 Fv或或 ScFv、單域抗體及最、單域抗體及最小識(shí)別單位小識(shí)別單位 等幾種。等幾種。 小分子抗體有很多優(yōu)點(diǎn)小分子抗體有很多優(yōu)點(diǎn) : 可以用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)，成本低可以用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)，成本低 。 分子小，穿透力強(qiáng)分子小，穿透力強(qiáng) 。 不含不含 Fc，沒(méi)有，沒(méi)有 Fc帶來(lái)的效應(yīng)帶來(lái)的效應(yīng) 。 在體內(nèi)循環(huán)的半衰期短，易清除，利于解毒排出在體內(nèi)循環(huán)的半衰期短，易清除，利于解毒排出 。 易于與毒素或酶基因連接，便于直接獲得免疫毒素或易于與毒素或酶基因連接，便于直接獲得免疫毒素或酶標(biāo)抗體等。酶標(biāo)抗體等。 3 小分子抗體小分子抗體Fv ScFv單區(qū)抗體單區(qū)抗體 最小識(shí)別單位最小識(shí)別單位Fab 由完整的由完整的 輕鏈和輕鏈和 Fd組成，大小為完整分子的組成，大小為完整分子的 1/3。 把把 Fab與細(xì)菌的前導(dǎo)肽相連，在前導(dǎo)肽的作用下與細(xì)菌的前導(dǎo)肽相連，在前導(dǎo)肽的作用下Fab進(jìn)入質(zhì)周腔，裝配折疊后，它具有結(jié)合抗原的進(jìn)入質(zhì)周腔，裝配折疊后，它具有結(jié)合抗原的活性?；钚浴?1)Fab Fv、 ScFv的大小約為全分子的的大小約為全分子的 1/6。(2)Fv 或或 ScFv FvScFv連接肽連接肽 Fv由由 VH與與 VL構(gòu)成，由于其結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合，故構(gòu)成，由于其結(jié)合是非共價(jià)結(jié)合，故Fv不穩(wěn)定。不穩(wěn)定。 在在 VH與與 VL之間加上一段連接肽，把之間加上一段連接肽，把 VH與與 VL連成一連成一條單鏈，得到條單鏈，得到 ScFv，即單鏈抗體，即單鏈抗體 。 連接肽連接肽 的長(zhǎng)度在的長(zhǎng)度在 1015個(gè)氨基酸左右，不宜太長(zhǎng)個(gè)氨基酸左右，不宜太長(zhǎng)或太短，它應(yīng)具有柔軟性，側(cè)鏈少，抗原性弱等特或太短，它應(yīng)具有柔軟性，側(cè)鏈少，抗原性弱等特點(diǎn)。常用的連接肽是點(diǎn)。常用的連接肽是 (GGGGS)3。 單鏈抗體單鏈抗體 的構(gòu)建在已知親本的構(gòu)建在已知親本 DNA序列時(shí)可用完全序列時(shí)可用完全人工合成法人工合成法 。 在具備親本單抗可變區(qū)的在具備親本單抗可變區(qū)的 cDNA克隆時(shí)，可用克隆時(shí)，可用 定點(diǎn)定點(diǎn)突變法突變法 在其兩端造成適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶位點(diǎn)，與人工合在其兩端造成適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶位點(diǎn)，與人工合成的連接肽編碼序列連接，組裝到表達(dá)載體中成的連接肽編碼序列連接，組裝到表達(dá)載體中 。 如果從雜交瘤細(xì)胞系構(gòu)建單鏈抗體，可用如果從雜交瘤細(xì)胞系構(gòu)建單鏈抗體，可用 PCR方方法法 擴(kuò)增可變區(qū)基因，再組裝到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體上。擴(kuò)增可變區(qū)基因，再組裝到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體上。 單鏈抗體單鏈抗體 最常用的最常用的 表達(dá)體系是表達(dá)體系是 大腸桿菌，大腸桿菌， 有有 2種種方式方式 : 一是表達(dá)為一是表達(dá)為 包涵或非包涵體的不溶蛋白包涵或非包涵體的不溶蛋白 。產(chǎn)量高。產(chǎn)量高，可達(dá)細(xì)菌蛋白總量的，可達(dá)細(xì)菌蛋白總量的 5%20%，但需進(jìn)行變性復(fù)性，但需進(jìn)行變性復(fù)性，使其形成正確的立體結(jié)構(gòu)，恢復(fù)抗體活性，使其形成正確的立體結(jié)構(gòu)，恢復(fù)抗體活性 。 二是二是 分泌型表達(dá)分泌型表達(dá) ，將細(xì)菌的信號(hào)肽序列與單鏈抗，將細(xì)菌的信號(hào)肽序列與單鏈抗體的氨基端相連，單鏈抗體分子就可分泌到質(zhì)周腔體的氨基端相連，單鏈抗體分子就可分泌到質(zhì)周腔和細(xì)菌體外，進(jìn)行折疊后成為有活性的分子。但產(chǎn)和細(xì)菌體外，進(jìn)行折疊后成為有活性的分子。但產(chǎn)量不及前者，一般實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下每升細(xì)菌的產(chǎn)量不及前者，一般實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下每升細(xì)菌的產(chǎn)量?jī)H在數(shù)毫克左右。量?jī)H在數(shù)毫克左右。 即為即為 VH，約為完整分子的，約為完整分子的 1/12。它只由一個(gè)結(jié)構(gòu)。它只由一個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，故稱域構(gòu)成，故稱 單域抗體。單域抗體。 單域抗體盡管親和力有所單域抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。降低，但仍保持著原單抗的特異性。 (3)單域抗體VH 約為完整分子的約為完整分子的 1/801/70大小，一般由一個(gè)大小，一般由一個(gè) CDR構(gòu)成，它也保持著抗體的特異性。構(gòu)成，它也保持著抗體的特異性。(4)最小識(shí)別單位CDR4 雙特異抗體和多價(jià)抗體雙特異抗體和多價(jià)抗體 雙鏈抗體雙鏈抗體 （（ Diabody）一詞最早由）一詞最早由 Hollinger等于等于1993年創(chuàng)造。乃是一種小分子的雙價(jià)雙特異性抗體片段。年創(chuàng)造。乃是一種小分子的雙價(jià)雙特異性抗體片段。 雙特異性抗體雙特異性抗體 (bispecific antibody,BSAb)是是指能同時(shí)識(shí)別指能同時(shí)識(shí)別 2種抗原的抗體。種抗原的抗體。 1種為對(duì)應(yīng)腫瘤相關(guān)種為對(duì)應(yīng)腫瘤相關(guān)抗原。另抗原。另 1種為
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1