【文章內容簡介】 A： Ⅰ 型：遠離識別部位隨即切割，非特異。 B： Ⅱ 型：在識別部位內部切割，特異。 C： Ⅲ 型：在識別部位后定點切割，特異。 單位： 1U： 在標準條件下， 1h完全水解 1μgλ噬菌體的酶量。 Ⅱ 型 DNA限制性內切酶： A： 識別核酸序列數(shù)目 46個。 B： 識別序列為回紋序列。 C： 切割后產生的末端分為粘行末端與平 末端。 例： PstⅠ 5ˊC↓ TGCAG3ˊ 3ˊGACGT↑ C5ˊ HaeⅢ 5ˊGG↓ CC3ˊ 3ˊCC↑ GG5ˊ ： 酶 +緩沖液 +樣品 一定的溫度 電泳檢測。 ： A： 星號活力。 B： 消化時間宜長不宜段。 C： 陽性可肯定序列，陰性序列不定。 （二）等位基因特異性寡核苷酸探針雜交分析法 allele specific oligonucleotide,ASO 根據(jù)鹼基互補的原則 ,制備識別特定寡核苷酸序列的單鏈 DNA探針 ,并標記示蹤物 ,在高強度條件下與變性 DNA樣品雜交 ,檢測示蹤物 ,陽性者為檢出相應的等位基因。 1. 相關概念： A： 雜交：兩條異源寡核苷酸單鏈按照鹼基互補的原則復性為雙鏈的過程。 B： 探針：標記有示蹤物，能夠識別靶核苷酸序列并與之退火雜交的具有以知序列的寡核苷酸單鏈。 2. 探針的條件 : A:長度為 20bp左右。 B： 具備高度特異性。 C： 容易標記示蹤物。 D： 在雜交過程中本身性質穩(wěn)定。 A:高靈敏度。 B:不影響探針的特異性。 C: 不影響探針的雜交特性。 D： 不改變本身的特性。 E： 檢測方法特異。 F： 安全可靠無公害。 G： 檢測方法簡單，重復性好。 4. 示蹤物的種類 A： 放射性同位素 靈敏度高，有放射性污染。 B： 非放射性同位素：半抗原 生物素 熒光物質 酶 — 常見辣根過氧花物酶 堿性磷酸酶 — 斑點印跡雜交 dot blot hybridization 反向斑點雜交 reverse dot blot A： 固相濾膜印跡 打點、 Southern轉移、 真空轉移、電轉移。常用尼龍膜。 B： DNA變性 — 堿變性、紫外線照射、真 空烘烤。 C：預雜交 — 封閉 D：雜交： 高強度雜交 溫度高，離子強度低。 特異不利于復性。 低強度雜交 溫度低，離子強度高。 利于復性不特異。 E： 漂洗 F： 示蹤物顯示。 三、等位基因特異性 PCR（ 序列特異性引物 PCR） allele specific PCR， ASPCR（ sequence specific primers,SSPPCR） 基本原理：根據(jù)待測等位基因的堿基差異設計 3條特異性引物，其中 2條引物為上游（或下游）引物，其 3端第 1個堿基（或第 3個堿基）分別與等位基因特異性堿基互補，作為等位基因特異性引物； 1條下游（或上游）引物作為共通引物。分為兩個體系同時 PCR擴增，對比電泳，依據(jù) PCR產物的有無判定等位基因的型別，有 PCR產物者為陽性，證實該等位基因存在。 方法 ： 1. 設計 3條引物， 2條等位基因特異性引物，其5端長度有差異（ 5端差 46bp）， 與共通引物引物在 1個體系中同時 PCR擴增，電泳后，依據(jù) PCR產物片段的有無與譜帶的位置判定等位基因的型別。 2. 同一片段多等位基因同時檢測：依據(jù)片段上等位基因數(shù)目，設計兩組多條等位基因特異性引物，分別與共通引物在 1個體系中同時 PCR擴增，對比電泳后，依據(jù) PCR產物片段的有無與譜帶的位置判定等位基因的型別。 3. 不同染色體上多等位基因同時檢測：設計兩組多條等位基因特異性引物及相應的共通引物，并在引物的 5端人工設計 10bp左右堿基序列， PCR產物對比電泳后，依據(jù) PCR產物片段的有無與譜帶的位置判定等位基因的型別。 技術關鍵點： 。 PCR反應條件。 四、隨機引物 PCR random primer PCR 特點： 1條引物。 。 10bp左右。 。 5. 擴增片段多 ,但符合孟德爾遺 傳規(guī)律。 ,增加信息含 量。 。 五、 PCR單鏈構型多態(tài)性分析 PCRsingle strand conformation polymorphism,PCRSSCP 基本原理： PCR產物熱變性后形成單鏈 DNA， 在非變性凝膠中，因 DNA 片段堿基排列順序的不同，單鏈 DNA形成不同的（空間構型，導 致電泳遷移率的差別而呈現(xiàn)多態(tài) 性，根據(jù)譜帶的位置判定型別。 特點： A： 樣品需要充分變性（加樣品緩沖液，沸水浴 10min）， 并保持至電泳前。 B： 電泳凝膠為非變性凝膠。 C： 泳動過程中溫度保持恒定。 D： 分辨率高，可檢測出單一堿基變異，檢出率 90% 以上。 E： 重復性稍差，多用于篩選實驗。 F： 不能確定突變堿基的種類與位置。 G： 樣品片段應短于 500bp。 H： 電泳譜型可能出現(xiàn)四條片段（ 1處變異）：同源雙 鏈；異源雙鏈；兩種堿基排列順序不同的單鏈 DNA。 六、擴增片段長度多態(tài)性檢測法 amplified fragment length polymorphism,AMPPCR 基本原理：應用一對特異性引物，選擇 VNTR或 STR基因座進行 PCR擴增，由于基因座不同等位基因串聯(lián)重復次數(shù)的差異，導致 PCR產物 DNA片段數(shù)目與長度不同，經(jīng)電泳后，依據(jù)譜帶的數(shù)目和位置判定型別。 特點： A： 操作簡單，重復性好。 B： 泳動中根據(jù)等位基因標準品認定型別。 C： 可檢測的基因座數(shù)量多。 D： 可將多基因座復合擴增。 [復合擴增要求 ]： A： 引物間無互補序列。 B： 基因座不在同一染色體上，或距離足夠遠。 C： 不同基因座 PCR產物片段長度分布不交叉。 D： 不同基因座 PCR擴增條件相近。 E： 片段長度差異不宜過大。（優(yōu)勢擴增） F：變性膠檢測效果好。 用于檢測的 STR基因座選擇條件： A： 重復序列堿基數(shù)目 35之間，易于分辨。 B： 等位基因數(shù)目適中， 10個左右。 C： 各等位基因頻率分布均勻。 D： 雜合度高。