基因分析的基本策略(編輯修改稿)
2025-02-07 14:42 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 Southernblot或 Northernblot或直接測(cè)序，從而對(duì)差異條帶鑒定分析，以便最終獲得差異表達(dá)的目的基因。 （ 1）差異顯示 PCR用于基因拷貝數(shù)分析 盡管應(yīng)用 差異顯示 PCR方法已經(jīng)取得了不少成果，而且該方法還在不斷改進(jìn)之中，但它仍然存在幾個(gè)難以解決的問(wèn)題：但它仍然存在幾個(gè)難以解決的問(wèn)題：(1)重復(fù)率低，至少有 20%的差異條帶不能被準(zhǔn)確重復(fù)；(2)假陽(yáng)性率可以高達(dá) 90%； (3)獲得的差異表達(dá)序列極少包含編碼信息。 （ 2）、代表性差異分析技術(shù) 該技術(shù)是將差減雜交與 PCR有機(jī)結(jié)合形成的一種方法 .主要步驟 : 將對(duì)照組 (driver)和待測(cè)組 (tester)mRNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA片段群 ,接上接頭進(jìn)行第一次 PCR擴(kuò)增 。 將兩組 PCR產(chǎn)物片段群用限制性內(nèi)切酶酶切 ,形成平均長(zhǎng)度256bp的長(zhǎng)度 . 將接頭消化 ,在 tester組末端接上新的接頭 ,tester組和driver組按 1:100比例混合 .過(guò)量的 driver可與 tester中互補(bǔ)的部分形成雙鏈 . 4\復(fù)性 ,按新接頭序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行第 2輪 PCR，只有 tester和tester雜合體才能和引物配對(duì) ,大量拉增 . 實(shí)時(shí) PCR根據(jù) PCR反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)設(shè)計(jì)的分析方法。在 PCR反應(yīng)的初始階段，反應(yīng)體系中的模板的產(chǎn)物深度較低，而引物是過(guò)量的，產(chǎn)物和模板復(fù)性不會(huì)形成與引物競(jìng)爭(zhēng)，此時(shí)產(chǎn)物含量呈指數(shù)增加。當(dāng) PCR產(chǎn)物積累后，產(chǎn)物的復(fù)性可以競(jìng)爭(zhēng)引物與模板的結(jié)合，產(chǎn)物增加減慢，最后進(jìn)入平臺(tái)期。所以對(duì)樣品中的 cDNA進(jìn)行定量分析的最佳時(shí)期是反應(yīng)早期。有人試圖依靠循環(huán)次數(shù)減少來(lái)分析樣品中的 cDNA含量，但因樣品的差異使之很不可靠。在一定的循環(huán)中， mRNA豐度低的樣品產(chǎn)量少，可能尚不能檢測(cè)，豐度高的樣品可能已進(jìn)入平臺(tái)期，故難以較。 （ 3）實(shí)時(shí) PCR用于基因拷貝數(shù)分析 實(shí)時(shí) PCR原理是：在 PCR反應(yīng)體系中加入一種雙色熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針，并根據(jù)探針上熒光信號(hào)的變化計(jì)算模板 DNA含量。如： TaqMan系統(tǒng) 在寡核苷酸探針的 5`端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光染料，3`端標(biāo)記一個(gè)猝滅染料。當(dāng)光源照射到探針時(shí)，被激活的報(bào)告熒光染料將能量轉(zhuǎn)移給附近的猝滅染料而不發(fā)光。當(dāng) PCR產(chǎn)物擴(kuò)增時(shí)，聚合酶遇到結(jié)合在模板上的熒光探針時(shí)，利用聚合酶所具有的 5`3`外切酶作用，將兩種染料分離，因此根據(jù)報(bào)告熒光所發(fā)射的熒光強(qiáng)度與被切探針成正比，由此可以計(jì)算出 PCR產(chǎn)物的含量。 ? 實(shí)時(shí) PCR技術(shù)特別適合于低拷貝基因的定量。 ? 實(shí)時(shí) PCR需要包括熱循環(huán)儀、計(jì)算機(jī)、光學(xué)儀器用于熒光激發(fā)和收集器、數(shù)據(jù)處理和分析軟件。 核酸保持在細(xì)胞或組織切片中，經(jīng)適當(dāng)方法處理細(xì)胞或組織后，將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱為 原位雜交 。 原位雜交不需要從組織提取核酸，對(duì)組織中含量極低的靶序列有很高的靈敏度，并可完整保持組織與細(xì)胞形態(tài)，更能準(zhǔn)確反映出組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)。 三、原位雜交技術(shù)可以分析基因在染色體上位置 根據(jù)檢測(cè)對(duì)象不同可將原位雜交分為 細(xì)胞內(nèi)原位雜交 和 組織切片原位雜交 。同時(shí)原位雜交既可檢測(cè)DNA，也可檢測(cè) RNA，所用探針不同而以。 核酸探針根據(jù)標(biāo)記方法的不同可粗略分為放射性探針和非放射性探針兩類。放射性 同位素標(biāo)記探針具有放射性既污染環(huán)境，又對(duì)人體有害，且受半衰期限制等缺點(diǎn)， 非放射性探針可以用生物素、地高辛 、熒光素標(biāo)記探針。 （一）、固定：保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最大限度地保持細(xì)胞內(nèi) DNA或 RNA的水平；使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。最常用的固定劑是多聚甲醛，其它的固定劑（如戊二醛）。 （二）、玻片和組織切片的處理：包括玻片處理、細(xì)胞組織切片的處理、降低背景、 預(yù)雜交。 （三）雜交： 調(diào)整探針的濃度（ ～ ） 、探針長(zhǎng)度（ 50～100個(gè)堿基） 、雜交的溫度和時(shí)間 （四）雜交后處理：包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。 （五）顯示：根據(jù)核酸探針標(biāo)記物的種類分別進(jìn)行放射自顯影或利用酶檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行不同顯色處理。 （ 六 ） 結(jié)果分析 基本方法 真核生物的 RNA包括 mRNA、 tRNA、 rRNA、snRNA、 snoRNA、 dsRNA、微小 RNA等。目前在上述 RNA研究中，以 mRNA研究最為熱點(diǎn)。它的研究可以提示基因的結(jié)構(gòu)、基因的活性、或基因的變異等。 mR
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