【文章內(nèi)容簡介】 化的相關(guān)基因 入手，研究基因的生物學(xué)功能，有可能抓住引起白內(nèi)障發(fā)生、發(fā)展的主要環(huán)節(jié)。據(jù)此，本研究擬利用改良的消減雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)準(zhǔn)確、全面、快速的特點(diǎn)，以晶狀體上皮細(xì)胞為研究對象，一次性篩選出老年性白內(nèi)障全部有差異表達(dá)的基因，從中再篩選出與白內(nèi)障相關(guān)基因，并著重對其功能進(jìn)行研究，從基因水平闡明白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制，為防治白內(nèi)障提供新思路和理論依據(jù)。 國內(nèi)外現(xiàn)狀分析（與綜述的區(qū)別） 存在問題： A、低水平重復(fù)： 不了解最新進(jìn)展，對國內(nèi)外現(xiàn) 狀缺乏真正了解，提出的問題別人已解決。 B、文獻(xiàn)復(fù)習(xí)不全： 檢索文獻(xiàn)方法不當(dāng)、選擇關(guān)鍵詞 不妥，甚至人為縮小檢索范圍。 C、總結(jié)表達(dá)不夠： 對國內(nèi)外現(xiàn)狀缺乏歸納分析， 只是簡單羅列，缺乏邏輯性和針對性。 D 、 對方法原理理解不夠： 對研究方法不熟悉，簡 單移植或夸大其作用，缺乏實(shí)際應(yīng)用的可行性。 撰寫方法： 要 緊緊圍繞 本次申請項(xiàng)目的主題。 A、從領(lǐng)域切入， 簡要論述 國內(nèi)外研究 成果 ，并引 出當(dāng)前的熱點(diǎn)研究方向。 B、從研究方向展開， 較詳細(xì)地分析 國內(nèi)外的研究 進(jìn)展 ，闡明在該方向上存在的問題。 C、圍繞存在的問題，結(jié)合國內(nèi)外以往的研究 結(jié)果、 當(dāng)前的 現(xiàn)狀 及今后的 發(fā)展趨勢 ， 詳細(xì)論述和分 析 這些問題產(chǎn)生的原因， 提出該方面的空白點(diǎn)、 未知數(shù)、以及研究的難點(diǎn)、焦點(diǎn)， 從而為自己 申請項(xiàng)目確立研究目標(biāo)奠定充分的立論基礎(chǔ)。 D、對擬采用的技術(shù)方法進(jìn)行介紹和分析。 成熟的方法 重點(diǎn)介紹可以應(yīng)用于本研究的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 新方法在詳細(xì)介紹其原理的基礎(chǔ)上 ，闡明可以應(yīng)用于本研究的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 需特別注意的問題： 必須對所運(yùn)用的技術(shù)方法的原理、流程尤其是在實(shí)際運(yùn)用中可能出現(xiàn)的問題要十分清楚， 絕不能是一種簡單的移植。 E、提出本項(xiàng)目的研究設(shè)想。 防治白內(nèi)障必須針對其發(fā)病的主要環(huán)節(jié)。多年以來，國內(nèi)外學(xué)者從不同的角度探討白內(nèi)障的發(fā)生機(jī)理。 就致病的環(huán)境因素講， 氧化因子、紫外線輻射、晶狀體周圍環(huán)境中離子濃度改變及一些生長因子、細(xì)胞因子的改變均與老年性白內(nèi)障的發(fā)生有關(guān)。 就研究的部位分， 晶狀體中皮質(zhì)與核的蛋白質(zhì)改變及晶狀體纖維的改變與白內(nèi)障的形成有關(guān)，而位于晶狀體前囊膜下單層的 晶狀體上皮細(xì)胞 在白內(nèi)障的形成中的變化更引人關(guān)注。 因?yàn)?晶狀體上皮細(xì)胞 是晶狀體中唯一有分裂活性、數(shù)量相對穩(wěn)定的細(xì)胞，它們分裂、分化出晶狀體纖維細(xì)胞、產(chǎn)生晶體蛋白，終生不停息，形成了晶狀體均一、對稱的結(jié)構(gòu)，對維持晶狀體的透明起重要作用。不僅如此， 晶狀體上皮細(xì)胞 還是晶狀體中 受外來刺激影響 較早的部位，已有研究證實(shí)老年性白內(nèi)障的晶狀體上皮細(xì)胞還發(fā)生 退行性變、細(xì)胞膜通透性增加、細(xì)胞內(nèi)酶活性改變、細(xì)胞數(shù)量減少、凋亡細(xì)胞增多等改變， 與單純老化的晶狀體之間存在差異 [35] 。 體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí) 多種因素 (H2O UVB、晶狀體蛋白的自身抗體 )誘發(fā)的白內(nèi)障模型中 晶狀體上皮的損傷是晶狀體混濁的主要環(huán)節(jié) [68]。 因此，從晶狀體上皮細(xì)胞的變化入手探討白內(nèi)障的成因，有可能抓住揭示白內(nèi)障發(fā)病機(jī)理的主要環(huán)節(jié)。而 晶狀體上皮細(xì)胞變化的基因調(diào)控機(jī)制 是問題的關(guān)鍵所在，也是有待我們深入研究的問題。 白內(nèi)障的形成與 晶狀體的老化 密不可分，是晶狀體老化的極端表現(xiàn)。晶狀體的老化是多種因素相互作用的結(jié)果， 包括基因的和非基因的隨機(jī)變化的不斷積累，也有程序性的、非隨機(jī)性的組織特異性 多種基因表達(dá)的改變。 目前，國內(nèi)外對白內(nèi)障相關(guān)基因的研究主要以下三方面： 一是對體外培養(yǎng)的晶狀體白內(nèi)障模型及上皮細(xì)胞的研究。 UVB輻射作用誘導(dǎo)的白內(nèi)障中晶狀體上皮細(xì)胞是主要的靶細(xì)胞，其 NaKATP酶的活性增加，蛋白質(zhì)的合成和分泌增加；上皮細(xì)胞的凋亡增加，其中有 cfos基因的表達(dá)增加；還有組蛋白 H H3 的低表達(dá) `和蛋白酶 C、β肌動蛋白、 γ肌動蛋白基因的高表達(dá) [912]。 Carper等 [13]利用 RTPCRDD(reverse transcriptionpolymerase chain reaction differential display)技術(shù)研究 H2O2誘導(dǎo)的晶體上皮細(xì)胞的基因差異性表達(dá)結(jié)果顯示 NADH脫氫酶 4亞基、細(xì)胞色素 b、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)減少以及細(xì)胞因子的核蛋白、替代拼接因子 2 （ alternative splicing factor）、 β三羥基異丁酰輔酶A水解酶基因表達(dá)的增加。 二是利用轉(zhuǎn)基因動物的研究。 波形纖維蛋白基因（ vimentin）、雜交的 Ⅲ 型中間纖維蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出白內(nèi)障，而且有隨小鼠年齡增加白內(nèi)障加重的趨勢。晶狀體改變的共同特點(diǎn)是晶狀體纖維細(xì)胞分化受抑制 [14,15]。 Gong等 [16]報(bào)告晶狀體的細(xì)胞膜蛋白連接蛋白 α3（ α3 Connexin）基因敲除小鼠（ knockout mouse）在晶狀體形成的早期及纖維細(xì)胞分化早期不受影響，其后出現(xiàn)與晶狀體蛋白溶解有關(guān)的核性白內(nèi)障。 雖然體外實(shí)驗(yàn)和白內(nèi)障轉(zhuǎn)基因小鼠都提示我們一些基因的變化與白內(nèi)障有關(guān)，但是，這些變化的基因是否與老年性白內(nèi)障形成有關(guān)，目前尚缺乏進(jìn)一步的報(bào)告。 三是對人老年性白內(nèi)障晶體上皮的研究。 Lee[17]利用 RTPCR技術(shù)研究顯示前極性白內(nèi)障與核性白內(nèi)障上皮細(xì)胞中纖維連接蛋白、 I型膠原纖維、 α平滑肌蛋白、TGFβ TGFβ TGFβⅡ 型受體、結(jié)締組織生長因子的基因表達(dá)有差異。 Kantorow等 [18]利用 RTPCRDD研究老年性白內(nèi)障與正常晶狀體上皮的基因差異性表達(dá)的初步結(jié)果是老年性白內(nèi)障有三個(gè)高表達(dá)基因和 12個(gè)低表達(dá)的基因。 但就 DDPCR技術(shù)來講，在實(shí)驗(yàn)中難以解決假陰性、假陽性以及克隆全長 cDNA的問題。 上述三方面的研究均取得了不同程度的研究結(jié)果，但由于當(dāng)時(shí)技術(shù)條件的限制都未能全面闡明與白內(nèi)障相關(guān)的基因及其功能。 尋找白內(nèi)障時(shí)晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞間 差異表達(dá)的基因 有可能揭示白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)理。 尋找差異表達(dá)基因的經(jīng)典方法是消減雜交技術(shù)（ subtractive hybridization, SH），它是 …… ，但是實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜。 經(jīng)過改進(jìn)后的抑制性消減雜交 （ suppression subtractive hybridization ,SSH是 Diatchenko等 1996年建立的方法） …… 簡化了實(shí)驗(yàn)操作，但仍然問題很多。 我校生化教研室 建立了改良消減雜交技術(shù) [19， 20]，其特點(diǎn)是： 簡便易行，能夠獲得目的細(xì)胞特異表達(dá)的全長基因，對低豐度基因也能有效分離。 該方法的建立者已利用這一技術(shù)從脂多糖刺激前后的人牙髓細(xì)胞的差異表達(dá)的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達(dá)的基因，其中 5個(gè)為新基因。同理，利用此方法也能快速、有效地獲得白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞間差異表達(dá)的基因，并克隆到全長 cDNA，為進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)和功能研究打下基礎(chǔ)。 基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)，使檢測差異表達(dá)基因和未知DNA分子變得更快捷、準(zhǔn)確、高效。 基因芯片是在 1996年被提出并開始研制的，該技術(shù)是將成千上萬的 DNA探針集中到 1厘米見方的基片上，利用堿基互補(bǔ)原理， DNA探針中的已知堿基序列與被測定的未知 DNA分子雜交后由標(biāo)記分子標(biāo)記雜交體，經(jīng)自動閱讀設(shè)備分析雜交結(jié)果，從而 對檢測基因進(jìn)行定性、定量和結(jié)構(gòu)分析，確定未知DNA分子。 由于目前尚沒有針對白內(nèi)障研究的現(xiàn)成基因芯片，根據(jù)本研究的需要，我們將篩選到的差異表達(dá)的所有基因建立 cDNA文庫，再利用基因芯片技術(shù) 制備成基因芯片 ，以此 檢測多個(gè)樣本中白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞間差異表達(dá)的基因， 從中 進(jìn)一步篩選出白內(nèi)障特異的基因 ，它們中可能有已知基因，也可能有未知基因。通過以上兩種技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，我們能更快捷、有效、準(zhǔn)確地得到白內(nèi)障相關(guān)基因。 綜上所述，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為研究白內(nèi)障發(fā)生過程中的功能基因及特異調(diào)控基因提供了有利武器。 本項(xiàng)目從晶狀體上皮細(xì)胞入手，利用改良的消減雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)系統(tǒng)研究與白內(nèi)障相關(guān)的基因，并采用對體外培養(yǎng)細(xì)胞和在體晶狀體上皮細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染，探討它們在晶狀體上皮細(xì)胞變化和白內(nèi)障形成中的作用，可望闡明白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞變化的分子生物學(xué)機(jī)制，為防治白內(nèi)障提供新的思路和理論依據(jù)。 參考文獻(xiàn) A、文獻(xiàn)類別要全 ：以英文文獻(xiàn)為主，同時(shí)也要引用 中文文獻(xiàn) 國內(nèi)同行中知名專家的文獻(xiàn)。 B、引文信息要全 ：文章題目、作者姓名、具體出處 （包括期刊名、年份、卷期、頁碼等）。 C、文獻(xiàn)年代要新 ：主要是近五年的文獻(xiàn)，最好能有 2023年的最新文獻(xiàn)。 三、研究方案 研究目標(biāo) 撰寫要求： 有限目標(biāo) ， 與研究內(nèi)容相呼應(yīng) 如：明確 …… 關(guān)系，揭示 …… 規(guī)律， 闡明 …… 原理（機(jī)制），建立 …… 方法等 舉例 ：篩選出與老年性白內(nèi)障相關(guān)的基因，明確部分基因在白內(nèi)障形成中的作用，從晶狀體上皮變化的角度闡明白內(nèi)障的發(fā)生機(jī)理，為防治白內(nèi)障提供線索。 研究內(nèi)容： 存在問題： 內(nèi)容過多，一個(gè)研究周期難以完成 內(nèi)容分散，不能