【文章內容簡介】 酸殘基，最大者甚至超過 4000個氨基酸殘基。若按氨基酸殘基平均分子量 110計，則蛋白質分子量范圍大約是 4 000440 000 Da(4440 kD)。 除某些特殊的環(huán)狀小肽外，寡肽和多肽都是線性分子，仍然保留一個未反應的氨基末端（ N末端）和一個羧基末端（ C末端）。 在某些蛋白質中， N末端往往被甲?；蛞阴；忾]；也有些蛋白質的 C末端被修飾成酰胺。 一條多肽鏈的模式結構如下所示 （圖 212） 。從該模式結構可以看出， 每種多肽或蛋白質都有相同的主鏈（ backbone） ,而每種多肽或蛋白質之間的差別則表現(xiàn)在多肽鏈中的氨基酸殘基順序的不同。 二．肽的性質 1．肽鍵可被水解 2．肽的解離性質 肽是一類多聚兩性電解質，隨環(huán)境 pH的變化，可以電離成帶正電荷、負電荷或者凈電荷為零等不同的狀態(tài)。每一種多肽都有它的等電點，可通過酸堿滴定曲線來確定。 等電點的差別反映出它們的氨基酸組成不同和側鏈可電離基團的種類和性質的差別 。 三．生物活性肽 幾乎所有生物體內部都存在多種非蛋白質肽。這類物質都有相應的生物活性，盡管人們并不完全清楚它們的功能。通常我們把這些肽類統(tǒng)稱為生物活性肽。生物活性肽在組成、結構和大小方面存在很大的差異。有的呈環(huán)形，有的有分支，有的還含有 D氨基酸和氨基酸類似物 （圖 213） 。 四．蛋白質的結構水平 可分為：一級、二級、三級、四級結構。 Section 4 蛋白質的一級結構和測定 蛋白質的一級結構測定是指蛋白質分子中氨基酸排列順序的測定。有二條途徑：一條是 直接測定 多肽鏈的氨基酸順序；另一條是 間接的 ，即從編碼蛋白質的基因的核苷酸順序來推導蛋白質的氨基酸順序。 一． 直接法： ① 獲得高純度的單一蛋白樣品，測定其分子大小。 ② 確定肽鏈的數(shù)目 (末端分析 )； ③ 氨基酸的組成分析； ④ 拆開二硫鍵； ⑤ 部分水解； ⑥ 片段的氨基酸順序測定； ⑦ 片段重疊，拚出完整肽鏈的氨基酸順序； ⑧ 確定二硫鍵和酰胺基的位置。 1. 氨基酸的組成分析 蛋白質在標準條件下經(jīng)酸水解后 , 進行氨基酸的組成分析 .通過組成分析基本上可推測出部分水解所產(chǎn)生的肽碎片的數(shù)目。 2． 末端分析 (確定蛋白質的肽鏈組成 ) ：通常測定肽鏈的 N末端 . 二硝基氟苯 (DNFB)法 或丹磺酰氯（ DNSCl）法是常用的方法。 丹磺酰氯 （圖 214） 為一種更有效的試劑，靈敏度比 DNFB法高 100倍。 1).還原法： 用 巰基乙醇 (HSCH2CH2OH)或 二硫蘇糖醇 等還原性試劑使二硫鍵打開，還原生成 SH（圖 215） 2).氧化法： 常用 過甲酸 (CHOOOH)作為氧化劑，使二硫鍵氧生成半胱氨磺酸 (磺基丙氨酸殘基 )（圖 215） 。 常用胰蛋白酶法 , 胰凝乳蛋白酶法和溴化氰法等方法 （ 216） 。下面是一個典型的多肽，用胰蛋白酶 (糜酶 )、胰凝乳蛋白酶和溴化氰分別處理所得到的結果： ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ Ala— Arg— Arg— Met— Phe— Ala— Lys— AspPheLeuLys 用胰酶處理 ： 用糜酶處理 ： 用溴化氰處理 ： AlaArg AlaArgArgMetPhe AlaArgArgMet Arg AlaLysAspPhe PheAlaLysAspPheLys AspPheLeuLys LeuLys MetPheAlaLys 5．肽碎片的氨基酸順序分析： ? Edman降解法 （圖 217） ：專用試劑是 苯異硫氰酸。 ? 羧肽酶法： 羧肽酶 A：從 C末端依次降解末端殘基，含芳香環(huán)的或脂肪烴基較大的殘基易被水解。但該酶不能水解 C末端的 Arg、 Lys和Pro。 羧肽酶 B能專門水解 C末端的 Arg和 Lys，對其它殘基不起作用。如果 C末端第二個殘基是 Pro，則酶 A和酶 B都不起作用。羧肽酶 C能水解 C末端的 Pro. ： 胰酶： AlaArg Arg MetPheAlaLys AspPheLeuLys 糜酶： AlaArg— ArgMetPhe AlaLys— AspPhe LeuLys 全順序 AlaArg— ArgMetPheAlaLys— AspPheLeuLys 六．蛋白質一級結構測定的生物學意義： 1. 蛋白質一級結構的種屬差異 同源蛋白質 (homologous proteins) 以胰島素和細胞色素 c為例說明。 圖 218示出了細胞色素 c 種系發(fā)生樹。 以血紅蛋白 (Hemoglobin)為例。 HbA: H3＋ N－ ValHisLeuThrProGluGluLys－ COO－ HbS: H3＋ N－ ValHisLeuThrProGluValLys－ COO－ Section 4 蛋白質空間結構 一 .蛋白質空間構象的概念及研究方法 蛋白質空間構象 是指蛋白質多肽鏈主鏈在空間上的走向及所有原子和基團在空間中的排列與分布。蛋白質的空間結構包括二級結構、三級結構和四級結構。 ? X射線晶體衍射和核磁共振光譜是研究大分子結構的主要方法。 X射線晶體衍射可用來研究處在晶體狀態(tài)下的蛋白質的空間結構 ,核磁共振 (NMR)光譜可用來研究處在溶液狀態(tài)的蛋白質的結構。 二 .蛋白質的二級結構 蛋白質的二級結構 是指蛋白質多肽鏈主鏈在空間中的走向。一般呈有規(guī)律的空間折疊。不涉及側鏈基因的構象。 肽鍵上的亞氨基、羰基和兩端的兩個 Cα 構成了一個肽平面 (或肽基或酰胺平面 ) （圖 219） ， 肽鍵上的 CN鍵具有部分雙鍵的性質 ， 只有有限的旋轉，因而使一條肽鏈因肽鍵旋轉所造成的構象數(shù)目受到限制。 但位于肽基兩側的 Cα 與氮原子間的連接鍵是純粹的單鍵， Cα 與羰基碳原子間的連接鍵也是純粹的單鍵 。 這兩個單鍵在剛性平面的任何一側都有較大的旋轉程度。 Cα N單鍵旋轉的角度用 Φ 表示， Cα C單鍵旋轉的角度用 ψ 表示。 但這兩個單鍵的旋轉也受到主鏈的酰胺氫和羰基氧的障礙和 α 碳原子上的側鏈基團的大小和性質的限制。由于Cα 實際上處于兩個剛性平面的交線上，所以由 Cα 參與形成的兩個 扭角 (φ 和 ψ )決定了相鄰兩個肽基的相對位置。多肽鏈主鏈的構象可用每 α 碳原子的一對扭角來描述。 實驗表明，肽鏈中所有肽基基本上都有相同的鍵距和鍵角，每個 α 碳原子都是一個正四面體結構。因此，多肽鏈主鏈的構象是由肽基上與每個 Cα 相連的兩個單鍵的旋轉所成的Φ 角和 ψ 角決定的。在多肽鏈中，任何一對扭角如發(fā)生變化，多肽鏈主鏈的構象必然發(fā)生相應的變化，如果所有與 Cα 相連的這一對扭角都分別相等，則多肽鏈主鏈呈現(xiàn)為有規(guī)律現(xiàn)象。 當多肽鏈處在完全伸展狀態(tài)時， Φ 角和 ψ 角規(guī)定為 180 176。 （圖 220） 。 螺旋結構是有規(guī)律的主鏈結構 α 螺旋 (α helix)是一種常見和穩(wěn)定的螺旋結構 （圖 221） 。由于與每個 α 碳原子相連的一對扭角在 α 螺旋 (α helix)結構中都分別相等 (Φ ＝ 57176。 ,ψ ＝ 47176。 )，因此， α 螺旋是多肽鏈主鏈的一種有規(guī)律的構象，是蛋白質分子中的普遍存在的一種典型的二級結構要素。 在 α 螺旋中，主鏈氫鍵是穩(wěn)定該結構的主要因素 （圖 221） 。氫鍵是蛋白質二級結構穩(wěn)定的作用力 。 氫鍵是在多肽鏈中第 n個殘基的羰基氧與螺旋方向的第 n ＋ 4個殘基的酰胺氫之間形成的（圖 222） 。 α 螺旋的提出，首先較好地解釋了存在于毛發(fā)中的 α 角蛋白 (α keratin)的結構特征 （圖 223） 。 α 螺旋構象 不僅存在于象 α 角蛋白這樣的纖維蛋白質中，而且 在球狀蛋白質分子中也廣泛存在 。 3. β 折疊片也是一種有規(guī)律的二級結構 在蛋白質結構中 , 存在兩種不同的 β 片，即 反平行的和平行的二種 （圖 224） 。 由于在每種折疊形式中 , 每對扭角都是分別相等的 , 故這兩種結構都是有規(guī)律的主鏈構象 。 在 β 片中 , 氫鍵的形成出現(xiàn)在相鄰肽鏈之間而不象 α 螺旋那樣出現(xiàn)在螺旋內 。 β 片由于有最適的氫鍵結合，與完全伸展的肽鏈構象不同，β 片呈波紋狀 （圖 225） ，故此名。 絲心蛋白 的 X射線晶體衍射分析表明，其空間結構與 α 角蛋白完全不同 ，呈現(xiàn)為 反平行的 β 片狀 （圖 226a 圖 226b） 。在絲心蛋白的長軸方向上具有 ，所以絲心蛋白的空間結構是 β 析疊式的。 β 片在球狀蛋白質分子中也廣泛存在 。 轉角和卷曲結構 大多數(shù)蛋白質都是球狀的。因此，多肽鏈必須具有彎曲、轉角和自然改變方向的能力，以便產(chǎn)生緊湊的球狀結構。在許多蛋白質中都可觀察到一種 稱作 β 轉角 (β turn orβ – bend) 的結構，它是由 4個連續(xù)的氨基酸殘基組成 （圖 227） 。 有兩種主要的β 轉角，都是通過一個殘基上的羰基氧與肽鏈下游的第三位殘基上的酰胺氫之間形成氫鍵，以此穩(wěn)定這種結構。由于 β 轉角的存在，就允許蛋白質彎曲并倒轉它的肽鏈方向， 脯氨酸和甘氨酸是頻繁出現(xiàn)在 β 轉角中的殘基。 卷曲結構 是一種難以描述的多肽鏈走向，也存在于球狀蛋白質分子中。 三、球狀蛋白質和三級結構 球狀蛋白質近似球形。蛋白質的三級結構 (tertiary structure) 和四級結構通常是針對球狀蛋白質而言。 蛋白質的三級結構 是指蛋白質分子中的所有原子的三維空間排列，包括它們的二級結構要素 (如 α 螺旋和 β 片 ) 和它們的側鏈在空間上的相互關系。 1. 三級結構的某些特征： 1). 球狀蛋白質常都含有 α 螺旋和 β 折疊片兩種基本要素 （圖 2 28） 2). 側鏈的定位隨極性而變化 3). 超二級結構 (supersecondary structure)即基元 (motif) 在許多蛋白質分子中常觀察到二級結構要素的某些組合，即 超二級結構或稱為基元 。這些組合有： ●βαβ 基元： 兩個平行的 β 鏈由一個 α 螺旋右手交聯(lián) ,為最常見的一種組合 （圖 229） 。 ●β 發(fā)夾基元： 由三條反平行的 β 鏈 (或肽段 )組成。 ●αα 基元： 由二條連續(xù)的反平行的 α 螺旋構成。 ●β 桶式 (β barrel) 基元： 由連續(xù)的 β 片卷筑而成 (有三種不同的形式 )。 4). 結構域 (domain) 分子較大的多肽鏈常折疊成兩個或多個球狀簇，這種球狀簇叫做域或結構域。大多數(shù)域由 100200個氨基酸殘基構成。平均直徑約 。結構域常具特殊功能，例如，結合小分子 (3磷酸甘油醛脫氫酶同 NAD的結合屬于這種情況 )（圖 230） 。 2. 蛋白質空間構象穩(wěn)定的因素 蛋白質多肽鏈在生理條件下折疊形成特定的空間構象顯然是熱力學上一種有利的過程，是各種作用力相互作用、精巧平衡的結果 。 ▲離子相互作用 ： 蛋白質分子的相反電荷基團的結合稱為鹽鍵或離子鍵 (離子對 ) （圖 231） 。 ▲氫鍵 : 氫鍵是一種由 弱酸性的供體基團 (DH)和一個具獨電子的原子 (A)之間形成的最顯著的靜電作用力。 蛋白質具有眾多的氫鍵供體和受體，包括主鏈上的羰基和酰胺基及極性側鏈基團。 ▲偶極與偶極間的相互作用 : 在電中性分子之間的非共價結合統(tǒng)稱為范德華力。 這種力產(chǎn)生于永久的或誘導的偶極之間的靜電相互作用。偶極與偶極間的相互作用包括永久偶極間的相互作用、永久偶極與誘導偶極間的作用和瞬時偶極間的作用 （圖 232） 。 ▲ 疏水作用 : 疏水作用是由于蛋白質多肽鏈的疏水殘基具有避開水的傾向、彼此在分子內聚集所產(chǎn)生的作用力 （圖 233） 。 這種力是維持蛋白質分子穩(wěn)定的主要的作用力。 ▲ 二硫鍵 : 二硫鍵是某些蛋白質維持結構穩(wěn)定性的主要因素，由兩個 Cys的側鏈 SH氧化而成 （圖 231） 。 四、寡聚蛋白質 (oligomeric protein)和四級結構 1. 四級結構研究的內容：