【文章內(nèi)容簡介】 ，就受到一次 “ 稀釋 ” 。所以，只能在選擇性培養(yǎng)基平板上形成一個微小菌落（即其中只有一個細(xì)胞是轉(zhuǎn)導(dǎo)子）。 流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)示意圖 （一）原核微生物基因重組 ? B、 局限轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并獲得表達(dá)的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。 ? ①只能轉(zhuǎn)導(dǎo)供體菌的個別特定基因 (一般為噬菌體整合位點(diǎn)兩側(cè)的基因 )；②該特定基因由部分缺陷（與完全缺陷相對而言）的噬菌體攜帶。 ? 分為低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)和高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)。 （一）原核微生物基因重組 ? 低頻轉(zhuǎn)導(dǎo) (LFT)： 用 低感染復(fù)數(shù)的 LFT裂解物感染宿主 ， 獲得極少量局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子的方式。（宿主染色體被不正常切離的頻率極低，故只能獲得極少量部分缺陷噬菌體，即極少量局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子） （一）原核微生物基因重組 ? 當(dāng)溫和噬菌體感染受體菌后，其染色體開環(huán)，以線狀形式整合到宿主染色體的特定位點(diǎn)上，使宿主細(xì)胞發(fā)生溶原化。該溶原菌因誘導(dǎo)而發(fā)生裂解時，有極少數(shù) (～ 105)的前噬菌體發(fā)生不正常切離，將插入位點(diǎn)兩側(cè)之一的少數(shù)宿主基因，連接到噬菌體DNA上，噬菌體也將相應(yīng)的一段 DNA遺留在宿主的染色體組上，通過衣殼的“誤包”，形成一種特殊的噬菌體 —（部分）缺陷噬菌體。當(dāng)它感染宿主并整合在宿主基因組上時，可使宿主細(xì)胞成為一個局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子，而不是一個溶原菌，不具有對相同溫和噬菌體的免疫性。 低頻轉(zhuǎn)導(dǎo) (LFT)裂解物的形成 （一）原核微生物基因重組 ? 高頻轉(zhuǎn)導(dǎo) (HFT)： 用高感染復(fù)數(shù)的 HFT裂解物感染其它 受體菌，高頻率地轉(zhuǎn)化為 +轉(zhuǎn)導(dǎo)子的方式。 （一）原核微生物基因重組 ? 用高感染復(fù)數(shù)的 LFT裂解物感染 受體菌（不發(fā)酵半乳糖的營養(yǎng)缺陷型），凡感染λdgal （ 帶供體菌 gal基因）噬菌體的細(xì)胞 ， 幾乎同時感染正常的 λ噬菌體。兩種噬菌體同時整合在一個受體菌核染色體組上 ， 受體菌成為雙重溶原菌。當(dāng)雙重溶原菌被紫外線等誘導(dǎo)時 ，正常 λ噬菌體（助體或輔助噬菌體）的基因可補(bǔ)償 λdgal 所缺失的部分基因功能 ， 兩種噬菌體同時獲得復(fù)制的機(jī)會；裂解物含有等量 λ和 λdgal 粒子 ， 稱 HFT裂解物。 （一）原核微生物基因重組 ? 溶原轉(zhuǎn)變：溫和噬菌體感染宿主使之溶原化，使宿主獲得除免疫性以外的新性狀的現(xiàn)象。當(dāng)宿主喪失這一噬菌體時，通過溶原轉(zhuǎn)變而獲得的性狀也同時消失。 ? 區(qū)別： 溫和噬菌體不攜帶供體菌基因； 噬菌體完整，沒有缺陷。 ? 典型例子：不產(chǎn)毒白喉棒狀桿菌菌株（ β噬菌體）－產(chǎn)白喉毒素。鴨沙門氏菌（ ε15噬菌體）－細(xì)胞表面多糖結(jié)構(gòu)變化。紅霉素鏈霉菌（ P4噬菌體）－紅霉素生物合成及形成氣生菌絲等能力。 （一）原核微生物基因重組 ? 接合：通過供體菌和受體菌完整細(xì)胞間直接接觸而傳遞大段 DNA的過程。 ? 細(xì)菌以生活在腸道內(nèi)的大腸桿菌、沙門氏菌 、志賀氏菌 、 賽氏桿菌 、 弧菌 、 固氮菌、克氏桿菌和假單胞桿菌等屬的一些種最為常見。 ? 放線菌研究得最多的是鏈霉菌屬、諾卡氏菌屬等 ， 尤以天藍(lán)色鏈霉菌最為詳細(xì)。 ? 接合還可發(fā)生在不同屬之間 ， 如大腸桿菌與鼠傷寒沙門氏菌或鼠傷寒沙門氏菌與痢疾志賀氏菌之間。 研究細(xì)菌接合方法的基本原理 （一）原核微生物基因重組 ? 大腸桿菌 F因子 (即致育因子或性質(zhì)粒 )： ? 獨(dú)立于染色體外的小型的環(huán)狀 DNA， 一般呈超螺旋狀態(tài)，具有自主的與染色體進(jìn)行同步復(fù)制和轉(zhuǎn)移到其他細(xì)胞中去的能力。還帶有一些對細(xì)胞生命活動關(guān)系較小的基因。 ? 分子量 5 107 ， DNA含量 2%， 1～ 4個／細(xì)胞。屬于附加體質(zhì)粒，既可脫離染色體獨(dú)立存在，也可插入 (即整合 )到染色體組上；既可經(jīng)過接合作用而獲得，也可通過一些理化因素 (如吖啶橙 、 利福平、環(huán)已亞胺和加熱等 )的處理從細(xì)胞中消失。 （一）原核微生物基因重組 ? 大腸桿菌的 4種類型： ? F (“雌性” )菌株：沒有 F因子 ,表面不具性菌毛。 ? F+ (“雄性” )菌株：細(xì)胞中存在游離 F因子 ,表面具性菌毛，數(shù)目與因子數(shù)相同。 ? Hfr(高頻重組 )菌株： F因子被整合在 DNA上。 ? F′菌株： Hfr的 F因子脫離 DNA,形成攜帶一小段(最多可達(dá) 1／ 3)染色體基因的游離 F因子 ,特稱 F′因子。該菌株稱為初生 F′菌株。 （一）原核微生物基因重組 ? 大腸桿菌的 接合 類型： ? F+ F ： F+通過性菌毛將 F因子轉(zhuǎn)移給 F成為 F+。 ? F因子傳遞 “ 滾環(huán)模型 ” ：① F因子的一條 DNA單鏈在特定位置上發(fā)生斷裂； ② 斷裂的單鏈逐漸解開 ， 同時以留下的另一條環(huán)狀單鏈作模板 ， 通過模板的旋轉(zhuǎn) ， 將解開的單鏈通過性菌毛推入 F中 ，同時 在供體細(xì)胞內(nèi) ， 重新合成一條新的環(huán)狀單鏈 ， 取代解開的單鏈 ； ③ F細(xì)胞中 ， 外來 DNA單鏈上也合成一條互補(bǔ)的新 DNA鏈 ， 恢復(fù)成環(huán)狀雙鏈 F因子 ，F(xiàn)變成了 F+。 （一）原核微生物基因重組 F′F 初生 F′菌株與 F 菌株接合，使之成為次生 F′菌株，含有質(zhì)?；蚝腿舾稍瓕?Hfr菌株的遺傳性狀。 通過質(zhì)粒來傳遞供體基因的方式，稱為 F質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)、 F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)、性導(dǎo)、 F質(zhì)粒媒介轉(zhuǎn)導(dǎo)。 （一）原核微生物基因重組 ? Hfr與 F ： 接合時 ， Hfr染色體在 F因子處發(fā)生斷裂 ， 由環(huán)狀變成線狀， F因子位于最末端。由于種種原因 ， 這種線狀染色體在轉(zhuǎn)移過程中經(jīng)常會發(fā)生斷裂 ， 越在前端的基因 ， 進(jìn)入的機(jī)會就越多 ， 在 F中出現(xiàn)重組子的時間就越早 ，頻率也高。 F因子位于最末端 ， 進(jìn)入的機(jī)會最少 ， 引起性別轉(zhuǎn)化的可能性也最小。因此 ，Hfr與 F接合的結(jié)果重組頻率雖高 ， 但卻很少出現(xiàn) F+的菌株，大多數(shù)情況下，仍是 F 。 F因子的存在方式及其相互關(guān)系 （二）真核微生物基因重組 ? 有性雜交：指性細(xì)胞間的接合和隨之發(fā)生染色體重組 ， 并產(chǎn)生新遺傳型后代的一種方式。能產(chǎn)生有性孢子者，均可采用有性雜交。 ? 準(zhǔn)性生殖：類似于有性生殖但更為原始的一種生殖方式?？墒雇簧锏膬蓚€不同來源的體細(xì)胞經(jīng)融合后，不通過減數(shù)分裂而導(dǎo)致低頻率的基因重組。 （二）真核微生物基因重組 ? 有性雜交 — ? 釀酒酵母：將甲、乙兩個雙倍體親本，分別接種到產(chǎn)孢培養(yǎng)基 (醋酸鈉培養(yǎng)基等 )斜面上，使其產(chǎn)生子囊，減數(shù)分裂，形成 4個單倍體子囊孢子。用蒸餾水洗下子囊，經(jīng)機(jī)械法 (加硅藻土和石蠟油，在勻漿管中研磨 )或酶法 (如蝸牛酶 )破環(huán)子囊，離心，獲得子囊孢子，涂布平板，培養(yǎng)，得到單倍體菌落。把兩個親體的不同性別的單倍體細(xì)胞密集接觸在一起，有機(jī)會出現(xiàn)雙倍體的雜交后代。雙倍體細(xì)胞和單倍體細(xì)胞有很大不同 ,易于識別。 雙倍體和單倍體細(xì)胞的比較 項(xiàng) 目 雙 倍 體 單 倍 體 細(xì)胞 菌落 液體培養(yǎng) 在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上 大 , 橢圓形 大 , 形態(tài)均一 繁殖較快 , 細(xì)胞較分散 形成子囊 小 , 球形 小 , 形態(tài)變化較多 繁殖較慢 , 細(xì)胞常聚集成團(tuán) 不形成子囊 （二）真核微生物基因重組 ? 準(zhǔn)性生殖： ? 菌絲聯(lián)結(jié)：形態(tài)沒有區(qū)別 , 遺傳性上有差別的兩個同種親本的單倍體體細(xì)胞間發(fā)生菌絲聯(lián)結(jié)。 ? 形成異核體：聯(lián)結(jié)后 ,原有的兩個單倍體核集中到同一個細(xì)胞中 ,形成雙相異核體。異核體能獨(dú)立生活。 ? 核配：異核體中的雙核偶爾可以發(fā)生核融合 ,產(chǎn)生雙倍體雜合子核。如構(gòu)巢曲霉、米曲霉核融合頻率為 105～ 107。某些理化因素如樟腦蒸汽、紫外線或高溫等的處理 ,可以提高頻率。 （二）真核微生物基因重組 ? 體細(xì)胞交換和單倍體化：體細(xì)胞交換即體細(xì)胞中染色體的交換 ,也稱有絲分裂交換 。 雙倍體雜合子性狀極不穩(wěn)定 ,在其進(jìn)行有絲分裂過程中 ,其中極少數(shù)核中的染色體會發(fā)生交換和單倍體化 ,從而形成了極個別具有新性狀的單倍體雜合子。如對雙倍體雜合子用紫外線、 γ 射線等進(jìn)行處理 ,就會促進(jìn)染色體斷裂、畸變或?qū)е氯旧w在兩個子細(xì)胞中分配不均 ,因而有可能產(chǎn)生各種不同性狀組合的單倍體雜合子。 半知菌的準(zhǔn)性生殖示意圖 準(zhǔn)性生殖和有性生殖的比較 項(xiàng) 目 準(zhǔn) 性 生 殖 有 性 生 殖 參與接合的親本細(xì)胞 獨(dú)立生活的異核體階段 接合后雙倍體的細(xì)胞形態(tài) 雙倍體變?yōu)閱伪扼w的途徑 接合發(fā)生的幾率 形態(tài)相同的體細(xì)胞 有 與單倍體基本相同 通過有絲分裂 偶然發(fā)現(xiàn) , 幾率低 形態(tài)或生理上有分化的性細(xì)胞 無 與單倍體明顯不同 通過減數(shù)分裂 正常出現(xiàn) , 幾率高 第三節(jié) 微生物育種 ? 目前，微生物發(fā)酵已由野生型菌株發(fā)酵向代謝調(diào)控發(fā)酵轉(zhuǎn)移。 ? 代謝調(diào)控發(fā)酵：利用遺傳學(xué)原理和方法，在DNA水平人為地改變和控制微生物代謝，使目的產(chǎn)物大量積累的發(fā)酵。 ? 關(guān)鍵之一：選育從遺傳角度解除了微生物正常代謝機(jī)制的突變株。 ? 方法：主要是誘變、雜交、遺傳工程等。 一、突變與育種 ? （一）、自發(fā)突變與育種： ? 生產(chǎn)選育：富于實(shí)際經(jīng)驗(yàn)并且善于細(xì)致觀察的人們在日常生產(chǎn)過程中，發(fā)現(xiàn)自然突變，選育優(yōu)良菌株。 ? 定向培育：用某一特定因素長期處理某一微生物培養(yǎng)物，同時不斷對它們進(jìn)行傳代，以達(dá)到累積并選擇相應(yīng)的自發(fā)突變體的一種古老的育種方法。過程十分緩慢， “ 守株待兔 ” 。 一、突變與育種 ? 分離篩選步驟 ? 采樣（土壤、食品等） ? 增殖培養(yǎng)（數(shù)量不足時） ? 純種分離（稀釋、劃線、組織分離等） ? 純培養(yǎng)（擴(kuò)大） ? 生產(chǎn)性能測定 一、突變與育種 ? （二）、誘變育種：利用物理或化學(xué)誘變劑處理均勻分散的細(xì)胞群，大幅度提高突變頻率，通過簡便、快速和高效的篩選，從中挑選符合育種目的的突變株。 ? 發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產(chǎn)部門使用的高產(chǎn)菌株，幾乎都是通過誘變育種而大大提高了生產(chǎn)性能的。提高產(chǎn)量、改進(jìn)質(zhì)量、擴(kuò)大品種和簡化生產(chǎn)工藝等，是使用最廣泛的育種手段之一。 一、突變與育種 ? 誘變育種的基本結(jié)果：以高產(chǎn)突變株為例 ? 誘變 出發(fā)菌株－－ {絕大多數(shù)死亡 少數(shù)存活 {多數(shù)未變 多數(shù)負(fù)變 少數(shù)突變 {少數(shù)正變少數(shù)正變 {多數(shù)幅度小 少數(shù)幅度大 {多數(shù)不宜投產(chǎn) ? 少數(shù)適宜投產(chǎn) 一、突變與育種 ? 誘變育種的基本路線： ? 確定出發(fā)菌株 → 純化選優(yōu) → 性能測定 →同步培養(yǎng) → 制備單細(xì)胞（單孢子）懸液→ 活菌濃度測定 → 誘變劑選擇與劑量確定預(yù)試驗(yàn) → 誘變處理 → 平板分離 → 計數(shù)（變異菌落與突變率） → 挑取疑似菌落純培養(yǎng) → 突變體初篩 →