【正文】 ℃ 時(shí)，群體中所有個(gè)體都不產(chǎn)色素。 (a)無(wú)毒菌系 RII不使白鼠死亡，從鼠體內(nèi)分離仍得無(wú)(b)將 SIII加熱殺死，不使白鼠死亡，鼠體內(nèi)無(wú)有毒細(xì)菌； (c)混合活 RII和加熱殺死的 SIII， 使白鼠死亡，并在死鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)活的 SIII細(xì)胞 （一）轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) ? 以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，加熱殺死的 S型細(xì)菌，在其細(xì)胞內(nèi)可能存在一種轉(zhuǎn)化物質(zhì)，它能通過(guò)某種方式進(jìn)入 R型細(xì)胞，并使 R型細(xì)胞獲得穩(wěn)定的遺傳性狀。微量純DNA(6 108g)， 仍有轉(zhuǎn)化能力。 ? 分離的 RNA能感染煙草患典型癥狀 ,病斑中能分離出正常病毒粒子。 ? （七）、核苷酸、堿基水平：最低突變單位或交換單位（ A、 G、 T、 C）。 四、原核生物的質(zhì)粒 ? cccDNA： 游離于染色體外，具有獨(dú)立復(fù)制能力的小型共價(jià)閉合環(huán)狀 DNA分子。 ? 少數(shù)質(zhì)?？梢栽诓煌觊g發(fā)生轉(zhuǎn)移 ， 如 F、 R等。 其二為 r質(zhì)粒（抗性決定質(zhì)粒），幾百萬(wàn)至 100 106Da以上。 ? 植物遺傳工程研究的重要載體。 ? 基因重組指把兩個(gè)不同性狀個(gè)體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過(guò)重新組合，形成新遺傳型個(gè)體。 ? B、 抗性突變型：能抵抗有害理化因素，分抗藥性、抗紫外線或抗噬菌體等。 ? 非選擇性突變：沒(méi)有選擇性標(biāo)記，只有一些性狀的數(shù)量差別。 （二）基因突變特點(diǎn) ? 誘變性 誘變劑可提高自變頻率 10～105倍。 堿基的置換（實(shí)－轉(zhuǎn)換、虛－顛換） （三）基因突變 機(jī)制 ? 直接置換誘變：直接與核酸堿基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的誘變劑，不論在機(jī)體內(nèi)或在離體條件下均有作用。 ? 染色體結(jié)構(gòu)變化，分染色體內(nèi)畸變和染色體間畸變。如果在加入該酶的同時(shí)又加入酶抑制劑 KCN， 則又可提高突變率。 ? 轉(zhuǎn)化后的受體菌，稱為轉(zhuǎn)化子。 （一）原核微生物基因重組 ? 轉(zhuǎn)導(dǎo)與溶源轉(zhuǎn)變： ? 通過(guò) 缺陷或溫和噬菌體的媒介 ，把供體細(xì)胞的 DNA片段攜帶到受體細(xì)胞中，從而使后者獲得了前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。供體菌裂解時(shí)，如把少量裂解物與大量的受體菌群相混，這種特殊噬菌體將外源 DNA片段導(dǎo)入受體菌。 ? ①只能轉(zhuǎn)導(dǎo)供體菌的個(gè)別特定基因 (一般為噬菌體整合位點(diǎn)兩側(cè)的基因 )；②該特定基因由部分缺陷（與完全缺陷相對(duì)而言）的噬菌體攜帶。兩種噬菌體同時(shí)整合在一個(gè)受體菌核染色體組上 ， 受體菌成為雙重溶原菌。 （一）原核微生物基因重組 ? 接合：通過(guò)供體菌和受體菌完整細(xì)胞間直接接觸而傳遞大段 DNA的過(guò)程。 （一）原核微生物基因重組 ? 大腸桿菌的 4種類型： ? F (“雌性” )菌株：沒(méi)有 F因子 ,表面不具性菌毛。 通過(guò)質(zhì)粒來(lái)傳遞供體基因的方式，稱為 F質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)、 F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)、性導(dǎo)、 F質(zhì)粒媒介轉(zhuǎn)導(dǎo)。可使同一生物的兩個(gè)不同來(lái)源的體細(xì)胞經(jīng)融合后，不通過(guò)減數(shù)分裂而導(dǎo)致低頻率的基因重組。 ? 核配：異核體中的雙核偶爾可以發(fā)生核融合 ,產(chǎn)生雙倍體雜合子核。 ? 關(guān)鍵之一：選育從遺傳角度解除了微生物正常代謝機(jī)制的突變株。 一、突變與育種 ? 誘變育種的基本結(jié)果：以高產(chǎn)突變株為例 ? 誘變 出發(fā)菌株－－ {絕大多數(shù)死亡 少數(shù)存活 {多數(shù)未變 多數(shù)負(fù)變 少數(shù)突變 {少數(shù)正變少數(shù)正變 {多數(shù)幅度小 少數(shù)幅度大 {多數(shù)不宜投產(chǎn) ? 少數(shù)適宜投產(chǎn) 一、突變與育種 ? 誘變育種的基本路線： ? 確定出發(fā)菌株 → 純化選優(yōu) → 性能測(cè)定 →同步培養(yǎng) → 制備單細(xì)胞（單孢子）懸液→ 活菌濃度測(cè)定 → 誘變劑選擇與劑量確定預(yù)試驗(yàn) → 誘變處理 → 平板分離 → 計(jì)數(shù)（變異菌落與突變率） → 挑取疑似菌落純培養(yǎng) → 突變體初篩 → 復(fù)篩 → 搖瓶發(fā)酵試驗(yàn) → 選出突變體 → 生產(chǎn)試驗(yàn)或重復(fù)誘變處理（詳情見(jiàn)教材） 一、突變與育種 ? 誘變育種的原則 ： ? 挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株 ? 處理單孢子 (或單細(xì)胞 )懸液 ? 選擇簡(jiǎn)便有效、最適劑量的誘變劑 一、突變與育種 ? 出發(fā)菌株是用于育種的原始菌株。如紫外線、 X射線、 γ射線和快中子等；烷化劑、堿基類似物和吖啶類化合物。 一、突變與育種 ? 誘變劑的復(fù)合處理常呈現(xiàn)一定的協(xié)同效應(yīng)。最好選擇對(duì)菌株生產(chǎn)性能沒(méi)有影響的標(biāo)記。最佳酶濃度是使形成率和再生率之積達(dá)到最大。細(xì)菌中多用蔗糖、丁二酸鈉、NaCl等，酵母菌中多用山梨醇、甘露醇等，霉菌中多用 KCl和 NaCl等。再生培養(yǎng)基必須加入具有一定滲透壓的基質(zhì)，成分因種而異。 二、原生質(zhì)體融合育種 ? 篩選實(shí)用性菌株 融合子類型是各種各樣的，存在性能和產(chǎn)量不同的情況。動(dòng)物細(xì)胞，主要是 SV40病毒。 ? 以重組質(zhì)粒作載體 ,用轉(zhuǎn)化方法； 以病毒DNA作重組載體 ,用感染方法。研究較多的是 α淀粉酶和青霉素酰化酶。如產(chǎn)孢能力喪失、發(fā)酵液產(chǎn)物組成改變、主產(chǎn)物減少和副產(chǎn)物增加等。 一、菌種退化及其防治 ? （二）、菌種退化的原因： ? 基因（負(fù)）突變。誘變處理后進(jìn)行充分的后培養(yǎng)及分離純化，以保證保藏菌種純粹，不再發(fā)生分離回復(fù)。 一、菌種退化及其防治 ? 菌種管理措施 定期針對(duì)性地進(jìn)行分離純化。 ? （三）、淘汰衰退個(gè)體：例如對(duì) “ 5406” 放線菌的分生孢子 ， 采用 10～ 30℃ 5～ 7天 ， 死亡率達(dá)80%， 在抗低溫的存活個(gè)體中 ， 留下了未退化的健壯個(gè)體。保藏期 1～ 10年。 三、菌種保藏 ? 農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心 (ACCC) 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，北京 (ISF)。 ? 日本“大阪發(fā)酵研究所” (IFO)。 三、菌種的保藏 ? 根據(jù)世界菌種保藏聯(lián)合會(huì)調(diào)查 ， 55個(gè)國(guó)家的菌種保藏機(jī)構(gòu)共有 352個(gè) ，許多大學(xué)及研究所都有自己的保藏機(jī)構(gòu)。 ? 3個(gè)著名實(shí)驗(yàn)者選用了微生物作為研究對(duì)象 ? ? 存在方式。 ? 西德“柯赫研究所” (RKI)。 三、菌種保藏 抗菌素菌種保藏管理中心 (CACC)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院抗菌素研究所，北京 (IA)； 四川抗菌素工業(yè)研究所，成都 (SIA)， 新抗菌素菌種；華北制藥廠抗菌素研究所，石家莊 (IANP)， 生產(chǎn)用抗菌素菌種。該法既可防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，又能使菌種與空氣隔絕。保持原種的優(yōu)良性狀不變，同時(shí)考慮方法的通用性和簡(jiǎn)便性。利用生產(chǎn)菌株的遺傳標(biāo)記，如營(yíng)養(yǎng)缺陷型及抗性等，進(jìn)行生長(zhǎng)譜平板檢查、藥物濃縮或抗性平板生長(zhǎng)等也是純化的方法。斜面保藏于 4℃ 時(shí)，突變的可能性大，且斜面保藏一般每 3個(gè)月到半年需傳代 1次，對(duì)菌種不利。 一、菌種退化及其防治 ? 非基因突變 。自發(fā)變異的單個(gè)細(xì)胞與其它細(xì)胞一起接入新鮮培養(yǎng)基時(shí)，由于細(xì)胞生理、代謝調(diào)節(jié)及產(chǎn)生產(chǎn)物的不同，在某些培養(yǎng)條件下，發(fā)生自發(fā)變異退化細(xì)胞的數(shù)量可能逐漸增多，經(jīng)過(guò)多次傳代能使此變異類型完全占優(yōu)勢(shì)而導(dǎo)致細(xì)胞群體的退化。目前美國(guó)已用基因工程菌生產(chǎn)。 基因工程的主要操作步驟 二、基因工程在微生物方面的應(yīng)用 ? 提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量：例如所有的氨基酸合成酶基因都可以在不同系統(tǒng)中克隆與表達(dá)。 一、基因工程的基本操作 ? （三）、目的基因與載體 DNA的體外重組：采用限制性內(nèi)切酶處理目的基因與載體 DNA， 獲得互補(bǔ)粘性末端或人工合成粘性末端。 ? 以純齒棒桿菌 B9和天津短桿菌 TG866為親株進(jìn)行質(zhì)體融合，初篩后發(fā)現(xiàn) ，有的根本不產(chǎn)生谷氨酸，如 F F3 F220等；有的產(chǎn)率很低，如 F1 F26 F300等；有的產(chǎn)率介于兩親株之間，如 F70； 有的產(chǎn)率較兩親株都高，如 F26 F288等。菌種本身的再生特性、原生質(zhì)體制備條件、再生培養(yǎng)基成分及再生培養(yǎng)條件等影響再生。 ? 此外，破壁 pH值、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)方式、離 二、原生質(zhì)體融合育種 ? 融合 ： 表面活性劑聚乙二醇 及 Ca2*、 Mg2*等陽(yáng)離子 ， 使融合頻率出現(xiàn)突破性提高。最適溫度是兩種效應(yīng)的共同結(jié)果。 二、原生質(zhì)體融合育種 ? 制備原生質(zhì)體 細(xì)菌和放線菌主要采用溶菌酶；酵母菌和霉菌可用蝸牛酶和纖維素酶。 誘變因子的復(fù)合處理及其協(xié)同效應(yīng) 單獨(dú)處理 復(fù)合處理 菌種 誘變劑 突變率 (%) 誘變劑 突變率 (%) 土曲霉 紫外線 X 射線 1 X 射線 + 紫外線 土曲霉 氮芥 (%) 紫外線 不明顯 氮芥 + 紫外線 鏈霉菌 紫外線 γ 射線 紫外線 + γ 射線 金色鏈霉菌 (2U 84) 二乙烯三胺 硫酸二乙酯 紫外線 二乙稀三胺 + 紫外線 硫酸二乙酯 + 紫外線 灰色鏈霉菌 (JIC 1) 紫外線 紫外線 + 可見(jiàn)光照射 1 次 紫外線 + 可見(jiàn)光照射 6 次 二、原生質(zhì)體融合育種 ? （一）基本原理 ： 將兩個(gè)親株細(xì)胞壁分別通過(guò)酶解作用加以剝除，在高滲環(huán)境中釋放出只有原生質(zhì)膜包被著的球狀原生質(zhì)體；將兩個(gè)親株的原生質(zhì)體在高滲條件下混合，由聚乙二醇(PEG)等助融，使細(xì)胞質(zhì)融合；通過(guò)兩套基因組之間的接觸、交換，發(fā)生基因組的遺傳重組，在再生細(xì)胞中獲得重組體。 ? 物理誘變劑劑量：強(qiáng)度時(shí)間，紫外線強(qiáng)度單位是爾格， X射線單位是倫琴或拉得等；化學(xué)誘變劑劑量：一定溫度下誘變劑濃度和處理時(shí)間。 一、突變與育種 ? 誘變育種必須使用均勻狀態(tài)的單細(xì)胞懸液。 一、突變與育種 ? （一）、自發(fā)突變與育種： ? 生產(chǎn)選育：富于實(shí)際經(jīng)驗(yàn)并且善于細(xì)致觀察的人們?cè)谌粘Ｉa(chǎn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)自然突變，選育優(yōu)良菌株。某些理化因素如樟腦蒸汽、紫外線或高溫等的處理 ,可以提高頻率。用蒸餾水洗下子囊，經(jīng)機(jī)械法 (加硅藻土和石蠟油，在勻漿管中研磨 )或酶法 (如蝸牛酶 )破環(huán)子囊，離心，獲得子囊孢子，涂布平板，培養(yǎng)，得到單倍體菌落。由于種種原因 ， 這種線狀染色體在轉(zhuǎn)移過(guò)程中經(jīng)常會(huì)發(fā)生斷裂 ， 越在前端的基因 ， 進(jìn)入的機(jī)會(huì)就越多 ， 在 F中出現(xiàn)重組子的時(shí)間就越早 ，頻率也高。 ? Hfr(高頻重組 )菌株： F因子被整合在 DNA上。 ? 放線菌研究得最多的是鏈霉菌屬、諾卡氏菌屬等 ， 尤以天藍(lán)色鏈霉菌最為詳細(xì)。 （一）原核微生物基因重組 ? 溶原轉(zhuǎn)變：溫和噬菌體感染宿主使之溶原化，使宿主獲得除免疫性以外的新性狀的現(xiàn)象。 （一）原核微生物基因重組 ? 低頻轉(zhuǎn)導(dǎo) (LFT)： 用 低感染復(fù)數(shù)的 LFT裂解物感染宿主 ， 獲得極少量局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子的方式。導(dǎo)入的供體 DNA片段可與受體染色體組上的同源區(qū)段配對(duì)，再通過(guò)雙交換而重組到受體菌染色體上，形成遺傳性穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。 ? 1952年在鼠傷寒沙門氏桿菌中發(fā)現(xiàn)。 轉(zhuǎn)化過(guò)程示意圖 G＋ 肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化