生物大分子的制備(編輯修改稿)
2025-01-17 22:17 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 其是在低溫時仍有相當(dāng)高的溶解度 ， 這是其他鹽類所不具備的 。 由于酶和各種蛋白質(zhì)通常是在低溫下穩(wěn)定 ， 因而鹽析操作也要求在低溫下 （ 0～ 4℃ ） 進行 。 由下表可以看到 ， 硫銨在0℃ 時的溶解度 ， 遠遠高于其它鹽類： ? 表 21 幾種鹽在不同溫度下的溶解度 （ 克 /100毫升水 ） ? 0℃ 20℃ 80℃ 100 ℃ （ NH4)2SO4 103 ? Na2SO4 ? NaH2PO4 101 ? ? ? ? ? 2) 分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨 鹽析 ， 一步就可以除去 75％ 的雜蛋白 ， 純 度提高了四倍 。 ? 3) 不易引起變性 ， 有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的 作用 。 有的酶或蛋白質(zhì)用 2～ 3mol/L濃度 的 （ NH4） 2SO4保存可達數(shù)年之久 。 ? 4) 價格便宜 ， 廢液不污染環(huán)境 。 ? ⑶ 鹽析的操作方法 ? 最常用的是固體硫酸銨加入法 。 將其研成細粉 ， 在攪拌下緩慢均勻少量多次地加入 ，接近計劃飽和度時 ， 加鹽的速度更要慢一些 ，盡量避免局部硫酸銨濃度過大而造成不應(yīng)有的蛋白質(zhì)沉淀 。 鹽析后要在冰浴中放置一段時間 ， 待沉淀完全后再離心與過濾 。 ? 在低濃度硫酸銨中鹽析可采用離心分離 ，高濃度硫酸銨常用過濾方法 。 ? 各種飽和度下需加固體硫酸銨的量可由附錄中查出 。 ? ⑷ 鹽析曲線的制作 ? 如果要分離一種新的蛋白質(zhì)和酶 ， 沒有文獻數(shù)據(jù)可以借鑒 ， 則應(yīng)先確定沉淀該物質(zhì)的硫酸銨飽和度 。 具體操作方法如下 (講義 p39)： 蛋白質(zhì)量 (mg)或酶活力 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫銨飽 和度 ％ ? ⑸ 鹽析的影響因素 ? 1) 蛋白質(zhì)的濃度：高濃度的蛋白質(zhì)用稍低的硫酸銨飽和度沉淀，若蛋白質(zhì)濃度過高，易產(chǎn)生各種蛋白質(zhì)的共沉淀作用。低濃度的蛋白質(zhì)，共沉淀作用小，但回收率降低。較適中的蛋白質(zhì)濃度是 ％～ ％，相當(dāng)于 25 mg/mL～ 30mg/mL。 ? 2) pH值對鹽析的影響：在等電點處溶解度小 ， pH值常選在該蛋白質(zhì)的等電點附近 。 ? 3) 溫度的影響：對于蛋白質(zhì) 、 酶和多肽等生物大分子 ， 在高離子強度溶液中 ， 溫度升高 ， 它們的溶解度反而減小 。 在低離子強度溶液或純水中蛋白質(zhì)的溶解度大多數(shù)還是隨濃度升高而增加的 。 一般情況下 ， 可在室溫下進行 。 但對于某些對溫度敏感的酶 ，要求在 0℃ ～ 4℃ 下操作 ， 以避免活力喪失 。 ? ? 有機溶劑沉淀法 ? ⑴ 基本原理 ? 有機溶劑對于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一。其原理主要是： ? ①降低水溶液的介電常數(shù)，向溶液中加入有機溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。 ? ②由于使用的有機溶劑與水互溶，它們在溶解于水的同時從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜，因而發(fā)生沉淀作用。 ? ? 有機溶劑沉淀法的優(yōu)點是： ? ① 分辨能力比鹽析法高 ， 即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)只在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀 。 ? ② 沉淀不用脫鹽 ， 過濾比較容易 （ 如有必要 ， 可用透析袋脫有機溶劑 ） 。 因而在生化制備中有廣泛的應(yīng)用 。 ? 其缺點是對某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活 ， 操作需在低溫下進行 。 ? ⑵ 有機溶劑的選擇和濃度的計算 ? 用于生化制備的有機溶劑的選擇首先是要能與水互溶。沉淀蛋白質(zhì)和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。 ? 為了獲得沉淀而不著重于進行分離，可用溶液體積的倍數(shù)：如加入一倍、二倍、三倍原溶液體積的有機溶劑，來進行有機溶劑沉淀。 ? ⑶ 有機溶劑沉淀的影響因素 ? 1) 溫度：多數(shù)生物大分子如蛋白質(zhì) 、 酶和核酸在有機溶劑中對溫度特別敏感 ， 溫度稍高就會引起變性 ， 且有機溶劑與水混合時產(chǎn)生放熱反應(yīng) ，因此必須預(yù)冷 ， 操作要在冰鹽浴中進行 ， 加入有機溶劑時必須緩慢且不斷攪拌以免局部過濃 。 ? 一般規(guī)律是溫度越低 ， 得到的蛋白質(zhì)活性越高 。 ? 2) 樣品濃度：低濃度樣品回收率低 ， 要使用比例更大的有機溶劑進行沉淀 。 高濃度樣品 ， 可以節(jié)省有機溶劑 ， 減少變性的危險 ， 但雜蛋白的共沉淀作用大 。 ? 通常使用 5mg/mL～ 20mg/mL的蛋白質(zhì)初濃度為宜 。 ? ? 3) pH值：選擇在樣品穩(wěn)定的 pH值范圍內(nèi) ， 通常是選在等電點附近 ， 從而提高此沉淀法的分辨能力 。 ? 4) 離子強度：鹽濃度太大或太小都有不利影響 ，通常鹽濃度以不超過 5％ 為宜 ， 使用乙醇的量也以不超過原蛋白質(zhì)水溶液的２倍體積為宜 ， 少量的中性鹽對蛋白質(zhì)變性有良好的保護作用 ， 但鹽濃度過高會增加蛋白質(zhì)在水中的溶解度 ， 降低了沉淀效果 ， 通常是在低濃度緩沖液中沉淀蛋白質(zhì) 。 ? 沉淀所得的固體樣品 ， 如果不是立即溶解進行下一步的分離 ， 則應(yīng)盡可能抽干沉淀 ， 減少其中有機溶劑的含量 ， 如若必要可以裝透析袋透析脫有機溶劑 ， 以免影響樣品的生物活性 。 ? 選擇性變性沉淀法 ? 這一方法是利用生物大分子與非目的生物大分子在物理化學(xué)性質(zhì)等方面的差異 ， 選擇一定的條件使雜蛋白等非目的物變性沉淀而得到分離提純 。 ? ⑴ 熱變性 ?
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