分子生物學(xué)研究法-食品伙伴網(wǎng)原食品伴侶網(wǎng)關(guān)注食品安全，(編輯修改稿)
2025-01-15 05:12 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 c． DNA序列分析自動(dòng)化 用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作為熒光劑標(biāo)記 DNA引物，帶有這種引物的 DNA片段能在激光誘導(dǎo)下發(fā)出熒光。按照標(biāo)準(zhǔn)的雙脫氧終止法或化學(xué)終止法進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，跑DNA凝膠后用計(jì)算機(jī)檢測(cè)。 (SBHSequencing by hybridization) ? 如果一段較短的 DNA探針能與較長的DNA片段雜交，并形成完全的雙鏈結(jié)構(gòu)，我們就推測(cè)在靶 DNA上存在著相應(yīng)的互補(bǔ)序列，這就是 DNA雜交測(cè)序法的基本原理。如果將一種 12mer的靶 DNA與完全隨機(jī)合成的 8mer寡核苷酸控針混合雜交，在總數(shù)為 48=65536種 8mer的控針群體中，僅有 5種探針會(huì)與靶 DNA雜交，形成完全互補(bǔ)的雙鏈分子。 ? 當(dāng)靶 DNA與標(biāo)記探針形成 GT或 GA末端堿基錯(cuò)配的雙鏈體時(shí)，檢測(cè)有一定難度。寡核苷酸探針越短，堿基錯(cuò)配造成的去穩(wěn)定效應(yīng)越明顯，較易與完全的雙鏈體分子相區(qū)分。但是，探針短，雜交產(chǎn)物的總體穩(wěn)定性下降，信 /噪比下降，影響結(jié)果的可靠性。所以， 6mer寡核苷酸矩陣芯片只能用于測(cè)定 500bp的靶 DNA； 7mer=2023bp， 8mer=8000bp。 ? SBH的應(yīng)用： ① 可有效檢測(cè)靶 DNA中的單堿基突變； ② 可用于不同 DNA片段之間的序列比較； ③ 可用于檢測(cè)不同生長發(fā)育狀態(tài)下細(xì)胞中特定基因的表達(dá)狀況； ④ 可用于檢驗(yàn)傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)的準(zhǔn)確性。 5． 基因的定點(diǎn)誘變（ sitedirected mutagenesis） 使已克隆基因或 DNA片段中的任何一個(gè)特定堿基發(fā)生取代、插入或缺失變化的過程叫作基因的定點(diǎn)誘變，是基因工程和蛋白質(zhì)工程的重要手段。 a. 盒式誘變 (cassette mutagenesis)，包括盒式取代誘變和混合寡核苷酸誘變兩種方式。 b．寡核苷酸引物誘變 應(yīng)用化學(xué)合成的含有突變堿基的寡核苷酸短片段做引物，進(jìn)行DNA復(fù)制，使寡核苷酸引物成為新合成的DNA子鏈的一個(gè)部分。 C． PCRG與 PCR誘變 6． 利用 DNA與蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)行核酸研究 . 實(shí)驗(yàn) (Gel retardation assay)， 又稱 DNA遷移率變化試驗(yàn) (DNA mobility shift assayEMSA)。 b． DNase I 印跡試驗(yàn)（ DNase I foot printing） ? 主要步驟： ① 用 32P標(biāo)記 DNA雙鏈末端，并用 RE切去一端； ② 加入細(xì)胞特定周期蛋白質(zhì)提取物，溫育； ③ 加入適量 DNaseI或硫酸二甲酯 六氫吡啶，使DNA鏈發(fā)生斷裂。 這一反應(yīng)中， DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常關(guān)鍵，要保證一條鏈只發(fā)生一次斷裂！ ④ 沉淀 DNA（包括與 DNA相結(jié)合的蛋白質(zhì)）； ⑤ 進(jìn)行 DNA凝膠分析。 ? 如果某個(gè)蛋白質(zhì)已經(jīng)與 DNA的特定區(qū)段相結(jié)合，那么，它就會(huì)保證該區(qū)段 DNA免受消化或降解作用。在電泳凝膠的放射自顯影圖片上，相應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)合的部位不產(chǎn)生放射性標(biāo)記的條帶。 c． 甲基化干擾試驗(yàn) (Methylation interference assay) ? 用 DMS處理靶 DNA，使平均每條鏈上只有一個(gè) G被甲基化。將局部甲基化的 DNA與含 DNA結(jié)合蛋白的細(xì)胞提取物共溫育后進(jìn)行凝膠滯緩試驗(yàn)。分離各種 DNA條帶，并用六氫吡啶切割甲基化的殘基。如果因某個(gè) G殘基的甲基化作用而阻止了蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，那么，六氫吡啶對(duì)這個(gè)甲基化 G殘基的切割作用，就只能在沒有蛋白質(zhì)結(jié)合的 DNA中觀察到。 d． 體內(nèi)足跡試驗(yàn) ? 用適量 DMS處理完整的游離細(xì)胞，使染色質(zhì)中的 G殘基甲基化，提取 DNA并加入六氫吡啶切割DNA鏈。與對(duì)照的裸露 DNA經(jīng)甲基化處理后形成的梯度相對(duì)照，就能發(fā)現(xiàn)DNA鏈上的蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)。 三、分子克隆技術(shù) 高質(zhì)量 mRNA的制備
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