國(guó)家自然科學(xué)基金申請(qǐng)標(biāo)書的書寫(編輯修改稿)
2024-09-11 21:14 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 的細(xì)胞特異表達(dá)的 全長(zhǎng)基因 ， 對(duì)低豐度基因也能有效分離 。 該方法的建立者已利用這一技術(shù)從脂多糖刺激前后的人牙髓細(xì)胞 的差異表達(dá)的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達(dá)的基因，其中 5個(gè)為新基因 。同理，利用此方法也能快速、有效地獲得白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞間差異表達(dá)的基因，并克隆到全長(zhǎng) cDNA，為進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)和功能研究打下基礎(chǔ)。 基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)，使檢測(cè)差異表達(dá)基因和未知DNA分子變得更快捷、準(zhǔn)確、高效。 基因芯片是在 1996年被提出并開(kāi)始研制的，該技術(shù)是將成千上萬(wàn)的 DNA探針集中到 1厘米見(jiàn)方的基片上，利用堿基互補(bǔ)原理， DNA探針中的已知堿基序列與被測(cè)定的未知 DNA分子雜交后由標(biāo)記分子標(biāo)記雜交體，經(jīng)自動(dòng)閱讀設(shè)備分析雜交結(jié)果，從而 對(duì)檢測(cè)基因進(jìn)行定性、定量和結(jié)構(gòu)分析，確定未知DNA分子。 由于目前尚沒(méi)有針對(duì)白內(nèi)障研究的現(xiàn)成基因芯片，根據(jù)本研究的需要，我們將篩選到的差異表達(dá)的所有基因建立 cDNA文庫(kù)，再利用基因芯片技術(shù) 制備成基因芯片 ，以此檢測(cè)多個(gè)樣本中白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞間差異表達(dá)的基因，從中 進(jìn)一步篩選出白內(nèi)障特異的基因 ，它們中可能有已知基因，也可能有未知基因。通過(guò)以上兩種技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，我們能更快捷、有效、準(zhǔn)確地得到白內(nèi)障相關(guān)基因。 綜上所述，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為研究白內(nèi)障發(fā)生過(guò)程中的功能基因及特異調(diào)控基因提供了有利武器。 本項(xiàng)目從晶狀體上皮細(xì)胞入手，利用改良的消減雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)系統(tǒng)研究與白內(nèi)障相關(guān)的基因，并采用對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞和在體晶狀體上皮細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染，探討它們?cè)诰铙w上皮細(xì)胞變化和白內(nèi)障形成中的作用，可望闡明白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞變化的分子生物學(xué)機(jī)制，為防治白內(nèi)障提供新的思路和理論依據(jù)。 參考文獻(xiàn) A、文獻(xiàn)類別要全 ：以英文文獻(xiàn)為主，同時(shí)也要引用 中文文獻(xiàn) 國(guó)內(nèi)同行中知名專家的文獻(xiàn)。 B、引文信息要全 ：文章題目、作者姓名、具體出處 （包括期刊名、年份、卷期、頁(yè)碼等）。 C、文獻(xiàn)年代要新 ：主要是近五年的文獻(xiàn)，最好能有 07年的最新文獻(xiàn)。 三、研究方案 研究目標(biāo) 撰寫要求： 有限目標(biāo) 如：明確 …… 關(guān)系，揭示 …… 規(guī)律， 闡明 …… 原理（機(jī)制），建立 …… 方法等 舉例 ：篩選出與老年性白內(nèi)障相關(guān)的基因，明確 部分 基因在白內(nèi)障形成中的作用， 從晶狀體上皮變化的角度 闡明白內(nèi)障的發(fā)生機(jī)理，為防治白內(nèi)障提供線索。 研究?jī)?nèi)容： 存在問(wèn)題： 內(nèi)容過(guò)多，一個(gè)研究周期難以完成 內(nèi)容分散，不能集中闡明研究目標(biāo) 撰寫要求： 為目標(biāo)服務(wù) — 需依據(jù)目標(biāo)確定內(nèi)容 要重點(diǎn)闡述 — 注意與技術(shù)路線區(qū)別 撰寫方法： 分若干分題 — 體現(xiàn)階段目標(biāo)和內(nèi)容 舉例 ： （ 1）篩選白內(nèi)障相關(guān)基因： 采用改良的消減雜交技術(shù)，獲得人老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞和正常晶狀體上皮細(xì)胞差異表達(dá)的基因片段，建立 cDNA文庫(kù)。制備差異表達(dá)基因的基因芯片，利用基因芯片技術(shù)從多個(gè)標(biāo)本的老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中篩選出白內(nèi)障相關(guān)基因。 （ 2）研究白內(nèi)障相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)： （ 3）研究白內(nèi)障相關(guān)基因在晶狀體上皮細(xì)胞變化中的作用 ： 觀察指標(biāo)如下： ①存活細(xì)胞數(shù) ； ②光鏡、透射電鏡下細(xì)胞形態(tài)的變化 ；③細(xì)胞凋亡檢測(cè) ：用原位末端標(biāo)記和連接酶介導(dǎo) PCR方法，從形態(tài)和 DNA水平分析細(xì)胞凋亡； ④細(xì)胞增殖的檢測(cè) ： … ；⑤細(xì)胞骨架蛋白的檢測(cè) ： … ； ⑥晶狀體蛋白的檢測(cè) ： … 。 擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題： 存在問(wèn)題： 抓不住關(guān)鍵問(wèn)題或抓得不準(zhǔn)。 什么是關(guān)鍵問(wèn)題 ？ 對(duì)達(dá)預(yù)期目標(biāo)有重要影響的某些研究?jī)?nèi)容或因素。 為達(dá)預(yù)期目標(biāo)所必須掌握的關(guān)鍵技術(shù)或研究手段。 撰寫要求： 找出關(guān)鍵問(wèn)題，提出解決辦法。 舉例 ： （ 1）建立差異表達(dá)的 cDNA文庫(kù) ： 建立差異 cDNA文庫(kù)是篩選老年性白內(nèi)障相關(guān)基因的前提。為使差異 cDNA文庫(kù)具有代表性，我們采取以下解決方案： ①選擇各種類型老年性白內(nèi)障晶狀體的前囊膜、取足夠大量的標(biāo)本（擬取 50例標(biāo)本）作為建庫(kù)的 mRNA的來(lái)源。 ②利用改良的消減雜交技術(shù)可快速、有效地獲得差異表達(dá)的完整 cDNA片段。此技術(shù)是本課題組成員主要的研究成果，在應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)中已積累了較豐富的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)。 研究方法 存在問(wèn)題： 過(guò)于簡(jiǎn)單：在方案中只有方法名稱而無(wú)具體步驟。 過(guò)于繁雜：大量羅列一些常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法。 撰寫要求： 以項(xiàng)目的需求為前提，盡量采用 最適合 的方法，并將其操作步驟和關(guān)鍵環(huán)節(jié)體現(xiàn)在技術(shù)路線當(dāng)中。 技術(shù)路線 存在問(wèn)題： 不清楚，不詳細(xì)，不可行。 撰寫方法： — 以時(shí)間順序?yàn)橹骶€設(shè)計(jì)技術(shù)路線
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