國(guó)家自然科學(xué)基金申請(qǐng)標(biāo)書的書寫-在線瀏覽
2024-09-25 21:14本頁面
【正文】 雖然體外實(shí)驗(yàn)和白內(nèi)障轉(zhuǎn)基因小鼠都提示我們一些基因的變化與白內(nèi)障有關(guān)，但是，這些變化的基因是否與老年性白內(nèi)障形成有關(guān)，目前尚缺乏進(jìn)一步的報(bào)告。 Lee[17]利用 RTPCR技術(shù)研究顯示前極性白內(nèi)障與核性白內(nèi)障上皮細(xì)胞中纖維連接蛋白 、 I型膠原纖維 、 α平滑肌蛋白 、 TGFβ TGFβ TGFβⅡ 型受體 、 結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的 基因表達(dá)有差異 。 但就 DDPCR技術(shù)來講 ， 在實(shí)驗(yàn)中難以解決假陰性 、假陽性以及克隆全長(zhǎng) cDNA的問題 。 尋找 白內(nèi)障時(shí)晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞間 差異表達(dá)的基因有可能揭示白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)理。 經(jīng)過改進(jìn)后的抑制性消減雜交 是 Diatchenko等 1996年建立的方法 ） …… 簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作 ，但仍然問題很多 。 該方法的建立者已利用這一技術(shù)從脂多糖刺激前后的人牙髓細(xì)胞 的差異表達(dá)的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達(dá)的基因，其中 5個(gè)為新基因 。 基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)，使檢測(cè)差異表達(dá)基因和未知DNA分子變得更快捷、準(zhǔn)確、高效。 由于目前尚沒有針對(duì)白內(nèi)障研究的現(xiàn)成基因芯片，根據(jù)本研究的需要，我們將篩選到的差異表達(dá)的所有基因建立 cDNA文庫，再利用基因芯片技術(shù) 制備成基因芯片 ，以此檢測(cè)多個(gè)樣本中白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞間差異表達(dá)的基因，從中 進(jìn)一步篩選出白內(nèi)障特異的基因 ，它們中可能有已知基因，也可能有未知基因。 綜上所述，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為研究白內(nèi)障發(fā)生過程中的功能基因及特異調(diào)控基因提供了有利武器。 參考文獻(xiàn) A、文獻(xiàn)類別要全 ：以英文文獻(xiàn)為主，同時(shí)也要引用 中文文獻(xiàn) 國(guó)內(nèi)同行中知名專家的文獻(xiàn)。 C、文獻(xiàn)年代要新 ：主要是近五年的文獻(xiàn)，最好能有 07年的最新文獻(xiàn)。 研究?jī)?nèi)容： 存在問題： 內(nèi)容過多，一個(gè)研究周期難以完成 內(nèi)容分散，不能集中闡明研究目標(biāo) 撰寫要求： 為目標(biāo)服務(wù) — 需依據(jù)目標(biāo)確定內(nèi)容 要重點(diǎn)闡述 — 注意與技術(shù)路線區(qū)別 撰寫方法： 分若干分題 — 體現(xiàn)階段目標(biāo)和內(nèi)容 舉例 ： （ 1）篩選白內(nèi)障相關(guān)基因： 采用改良的消減雜交技術(shù)，獲得人老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞和正常晶狀體上皮細(xì)胞差異表達(dá)的基因片段，建立 cDNA文庫。 （ 2）研究白內(nèi)障相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)： （ 3）研究白內(nèi)障相關(guān)基因在晶狀體上皮細(xì)胞變化中的作用 ： 觀察指標(biāo)如下： ①存活細(xì)胞數(shù) ； ②光鏡、透射電鏡下細(xì)胞形態(tài)的變化 ；③細(xì)胞凋亡檢測(cè) ：用原位末端標(biāo)記和連接酶介導(dǎo) PCR方法，從形態(tài)和 DNA水平分析細(xì)胞凋亡； ④細(xì)胞增殖的檢測(cè) ： … ；⑤細(xì)胞骨架蛋白的檢測(cè) ： … ； ⑥晶狀體蛋白的檢測(cè) ： … 。 什么是關(guān)鍵問題 ？ 對(duì)達(dá)預(yù)期目標(biāo)有重要影響的某些研究?jī)?nèi)容或因素。 撰寫要求： 找出關(guān)鍵問題，提出解決辦法。為使差異 cDNA文庫具有代表性，我們采取以下解決方案： ①選擇各種類型老年性白內(nèi)障晶狀體的前囊膜、取足夠大量的標(biāo)本（擬取 50例標(biāo)本）作為建庫的 mRNA的來源。此技術(shù)是本課題組成員主要的研究成果，在應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)中已積累了較豐富的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)。 過于繁雜：大量羅列一些常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法。 技術(shù)路線 存在問題： 不清楚，不詳細(xì)，不可行。 — 詳細(xì)地寫清楚每個(gè)具體步驟。 正常晶狀體上皮細(xì)胞取自角膜移植供體眼的晶狀體 ， 在顯微鏡下撕下前囊膜 ， 直徑約8mm。 （ 2） 建立差異 cDNA文庫： 從 50例白內(nèi)障手術(shù)患者的前囊膜上取下的晶狀體上皮細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組 ， 從 25例正常晶狀體前囊膜上取下的晶狀體上皮細(xì)胞作為對(duì)照組 ， 利用改良的消減雜交技術(shù) [19， 20]， 獲得差異表達(dá)的 cDNA， 并建立文庫 。 System 1000 mRNA分離 mRNA分離 oligodT18反轉(zhuǎn)錄 ntech Capfinder方法反轉(zhuǎn)錄 cDNA Biotin21dUTP pendingcDNA 隨機(jī)引物 PCR 雜交 Sephacryl S400柱 除鹽及小片段 鏈親和素 生物素磁性分離 除去雜交體及過量正常晶狀體上皮細(xì)胞 cDNA “ 長(zhǎng)距離”
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