【文章內(nèi)容簡介】 4)上工作臺后，用酒精棉球擦拭雙手，特別是指甲處。然后擦拭工作臺面； ? (5)先用酒精棉球擦拭接種工具，再將鑷子和剪子從頭至尾過火一遍，然后反復(fù)過火尖端處，對培養(yǎng)皿要過火烤干； ? (6)接種時，接種員雙手不能離開工作臺，不能說話、走動和咳嗽等； ? (7)接種完畢后要清理干凈工作臺，可用紫外燈滅菌 30min。 ? 若連續(xù)接種，每 5天要大強度滅菌一次。 三、接種 ? (1)將初步洗滌及切割的材料放人燒杯，帶入超凈臺上，用消毒劑滅菌，再用無菌水沖洗，最后瀝去水分，取出放置在滅過菌的 4層紗布上或濾紙上。 ? (2)材料吸干后，一手拿鑷子，一手拿剪子或解剖刀，對材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈睢Ｈ缛~片切成 ；莖切成含有一個節(jié)的小段。微莖尖要剝成只含 l— 2片幼葉的莖尖大小等。在接種過程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。 ? (3)用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上。具體操作過程是：先解開包口紙，將試管幾乎水平拿著，使試管囗靠近酒精燈火焰，并將管口在火焰上方轉(zhuǎn)動，使管口里外灼燒數(shù)秒鐘。若用棉塞蓋口，可先在管口外面灼燒，去掉棉塞，再燒管口里面。然后用鑷子夾取一塊切好的外植體送入試管內(nèi)，輕輕插入培養(yǎng)基。若是葉片直接附在培養(yǎng)基上，以放 1— 3塊為宜。至于材料放置方法除莖尖、莖段要正放 (尖端向上 )外，其他尚無統(tǒng)一要求。放置材料數(shù)量現(xiàn)在傾向少放，通過統(tǒng)計認(rèn)為：對外植體每次接種以一支試管放一枚組塊為宜，這樣可以節(jié)約培養(yǎng)基和人力，一旦培養(yǎng)物污染可以拋棄，接完種后，將管口在火焰上再灼燒數(shù)秒鐘。并用棉塞，塞好后，包上包口紙，包囗紙里面也要過火。 第二節(jié) 培養(yǎng)和馴化 ? 指把培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)室 (有光照、溫度條件 )里，使之生長，分裂和分化形成愈傷組織或進(jìn)一步分化成再生植株的過程。 1．培養(yǎng)方法 ? (1)固體培養(yǎng)法 即用瓊脂固化培養(yǎng)基來培養(yǎng)植物材料的方法。是現(xiàn)在最常用的方法。雖然該方法設(shè)備簡單，易行，但養(yǎng)分分布不均，生長速度不均衡，并常有褐化中毒現(xiàn)象發(fā)生。 ? (2)液體培養(yǎng)法 即用不加固化劑的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)植物材料的方法。由于液體中氧氣含量較少，所以通常需要通過攪動或振動培養(yǎng)液的方法以確保氧氣的供給，采用往復(fù)式搖床或旋轉(zhuǎn)式搖床進(jìn)行培養(yǎng)，其速度一般為 50100r／ min，這種定期浸沒的方法，既能使培養(yǎng)基均一，又能保證氧氣的供給。 2．培養(yǎng)步驟 ? (1)初代培養(yǎng) 初代培養(yǎng)旨在獲得無菌材料和無性繁殖系。即接種某種外植體后，最初的幾代培養(yǎng)。初代培養(yǎng)時，常用誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基中含有較多的細(xì)胞分裂素和少量的生長素。初代培養(yǎng)建立的無性繁殖系包括：莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等。根據(jù)初代培養(yǎng)時發(fā)育的方向可分為： 1)頂芽和腋芽的發(fā)育 ? 采用外源的細(xì)胞分裂素，可促使具有頂芽或沒有腋芽的休眠側(cè)芽啟動生長，從而形成 一個微型的多枝多芽的小灌木叢狀的結(jié)構(gòu)。在幾個月內(nèi)可以將這種叢生苗的一個枝條轉(zhuǎn)接繼代，重復(fù)芽 —— 苗增殖的培養(yǎng)，并且迅速獲得多數(shù)的嫩莖。然后將一部分嫩莖轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，就能得到可種植到土壤中去的完整的小植株。一些木本植物和少數(shù)草本植物也可以通過這種方式來進(jìn)行再生繁殖，如月季、茶花、菊花、香石竹等等。這種繁殖方式也稱作微型扦插，它不經(jīng)過發(fā)生愈傷組織而再生，所以是最能使無性系后代保持原品種特性的一種繁殖方式。 ? 適宜這種再生繁殖的植物，在采樣時，只能采用頂芽、側(cè)芽或帶有芽的莖切段，其他如種子萌發(fā)后取枝條也可以。 ? 莖尖培養(yǎng)可看作是這方面較為特殊的一種方式。它采用極其幼嫩的頂芽的莖尖分生組織作為外植體進(jìn)行接種。在實際操作中，采用包括莖尖分生組織在內(nèi)的一些組織來培養(yǎng)，這樣便保證了操作方便以及容易成活。 ? 用靠培養(yǎng)定芽得到的培養(yǎng)物一般是莖節(jié)較長，有直立向上的莖梢，擴(kuò)繁時主要用切割莖段法，如香石竹、矮牽牛、菊花等。但特殊情況下也會生出不定芽，形成芽叢。 2)不定芽的發(fā)育 ? 在培養(yǎng)中由外植體產(chǎn)生不定芽，通常首先要經(jīng)脫分化過程，形成愈傷組織的細(xì)胞。然后，經(jīng)再分化，即由這些分生組織形成器官原基，它在構(gòu)成器官的縱軸上表現(xiàn)出單向的極性 (這與胚狀體不同 )。多數(shù)情況下它先形成芽，后形成根。 ? 另一種方式是從器官中直接產(chǎn)生不定芽，有些植物具有從各個器官上長出不定芽的能力如矮牽牛、福祿考、懸鉤子等。當(dāng)在試管培養(yǎng)的條件下，培養(yǎng)基中提供了營養(yǎng)，特別是提供了連續(xù)不斷植物激素的供應(yīng)，使植物形成不定芽的能力被大大地激發(fā)起來。許多種類的外植體表面幾乎全部為不定芽所覆蓋。在許多常規(guī)方法中不能無性繁殖的種類，在試管條件下卻能較容易地產(chǎn)生不定芽而再生，如柏科，松科，銀杏等一些植物。許多單子葉植物儲藏器官能強烈地發(fā)生不定芽，用臼合鱗片的切塊就可大量形成不定鱗莖。 ? 在不定芽培養(yǎng)時，也常用誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基。用靠培養(yǎng)不定芽得到的培養(yǎng)物，一般采用芽叢進(jìn)行繁殖，如非洲菊、草莓等。 3)體細(xì)胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育 ? 體細(xì)胞胚狀體類似于合子胚但又有所不同，它也通過球形、心形、魚雷形和子葉形的胚胎發(fā)育時期，最終發(fā)育成小苗。但它是由體細(xì)胞發(fā)生的。胚狀體可以從愈傷組織表面產(chǎn)生，也可從外植體表面已分化的細(xì)胞中產(chǎn)生，或從懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生，也可從外植體表面已分化的細(xì)胞中產(chǎn)生，或從懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生。 (2)繼代培養(yǎng) ? 在初代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上所獲得的芽、苗、胚狀體和原球莖等，數(shù)量都還不多，它們需要進(jìn)一步增殖，使之越來越多，從而發(fā)揮快速繁殖的優(yōu)勢。 ? 繼代培養(yǎng)是繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴(kuò)繁培養(yǎng)過程。旨在繁殖出相當(dāng)數(shù)量的無根苗，最后能達(dá)到邊繁殖邊生根的目的。繼代培養(yǎng)的后代是按幾何級數(shù)增加的過程。如果以 2株苗為基礎(chǔ)，那么經(jīng) 10代將生成 210株苗。 ? 繼代培養(yǎng)中擴(kuò)繁的方法包括：切割莖段、分離芽叢、分離胚狀體、分離原球莖等。切割莖段常用于有伸長的莖梢、莖節(jié)較明顯的培養(yǎng)物。這種方法簡便易行，能保持母種特性。培養(yǎng)基常是 MS0基本培養(yǎng)基；分離芽叢適于由愈傷組織生出的芽叢。培養(yǎng)基常是分化培養(yǎng)基。若芽叢的芽較小，可先切成芽叢小塊，放人 MS0培養(yǎng)基中，待到稍大時，再分離開來繼續(xù)培養(yǎng)。 ? 增殖使用的培養(yǎng)基對于一種植物來說每次幾乎完全相同．由于培養(yǎng)物在接近最良好的環(huán)境條件，營養(yǎng)供應(yīng)和激素調(diào)控下，排除了其他生物的競爭，所以能夠按幾何級數(shù)增殖；； ? 在快速繁殖中初代培養(yǎng)只是一個必經(jīng)的過程，而繼代培養(yǎng)則是經(jīng)常性不停的進(jìn)行過程。但在達(dá)到相當(dāng)?shù)臄?shù)量之后，則應(yīng)考慮使其中一部分轉(zhuǎn)入生根階段。從某種意義上講，增殖只是貯備母株，而生根才是增殖材料的分流，生產(chǎn)出成品。 培養(yǎng)過程中常出現(xiàn)的問題及解決方法 初代培養(yǎng)外植體的褐變 ? 外植體褐變是指在接種后，其表面開始褐變，有時甚至?xí)拐麄€培養(yǎng)基褐變的現(xiàn)象。它的出現(xiàn)是由于植物組織中的多酚氧化酶被激活，而使細(xì)胞的代謝發(fā)生變化所致。在褐變過程中，會產(chǎn)生醌類物質(zhì)，它們多呈棕褐色，當(dāng)擴(kuò)散到培養(yǎng)基后，就會抑制其他酶的活性，從而影響所接種外植體的培養(yǎng)。 褐變的主要原因 ? ① 植物品種 研究表明，在不同品種間的褐變現(xiàn)象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差異，因此，有些花卉品種的外植體在接種后較容易褐變，而有些花卉品種的外植體在接種后不容易褐變。因此，在培養(yǎng)過程中應(yīng)該有所選擇，對不同的品種分別進(jìn)行處理。 ? ②生理狀態(tài) 由于外植體的生理狀態(tài)不同，所以在接種后褐變程度也有所不同。一般來說，處于幼齡期的植物材料褐變程度較淺，而從已經(jīng)成年的植株采收的外植體，由于含醌類物質(zhì)較多，因此褐變較為嚴(yán)重。一般來說，幼嫩的組織在接種后褐變程度并不明顯，而老熟的組織在接種后褐變程度較為嚴(yán)重。 ? ③培養(yǎng)基成分 濃度過高的無機鹽會使某些觀賞植物的褐變程度增加，此外，細(xì)胞分裂素的水平過高也會刺激某些外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐變現(xiàn)象加深。 ? ④培養(yǎng)條件不當(dāng) 如果光照過強、溫度過高、培養(yǎng)時間過長等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速被培養(yǎng)的外植體的褐變程度。 減輕褐變現(xiàn)象發(fā)生的方法 ? ① 選擇合適的外植體 一般來說，最好選擇生長處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。 ? ②合適的培養(yǎng)條件 無機鹽成分、植物生長物質(zhì)水平、適宜溫度、及時繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。 ? ③使用抗氧化劑 在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸、 PVP等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現(xiàn)象。另外，使用 %%的活性炭對防止褐變也有較為明顯的效果。 ? ④連續(xù)轉(zhuǎn)移 對容易褐變的材料可間隔 12~24h的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過連續(xù)處理 7l0d后，褐變現(xiàn)象便會得到控制或大為減輕。 繼代培養(yǎng)時材料的玻璃化 ? 實踐表明，當(dāng)植物材料不斷地進(jìn)行離體繁殖時，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會呈半透明水漬狀，這種現(xiàn)象通常稱為玻璃化。它的出現(xiàn)會使試管苗生長緩慢、繁殖系數(shù)有所下降。玻璃化為試管苗的生理失調(diào)癥。 ? 因為出現(xiàn)玻璃化的嫩莖不宜誘導(dǎo)生根，因此，使繁殖系數(shù)大為降低。在不同的種類、品種間，試管苗的玻璃化程度也有所差異。當(dāng)培養(yǎng)基上細(xì)胞分裂素水平較高時，也容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。在培養(yǎng)基中添加少量聚乙烯醇、脫落酸等物質(zhì)，能夠在一定程度上減輕玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生。 ? 呈現(xiàn)玻璃化的試管苗，其莖、葉表面無蠟質(zhì)，體內(nèi)的極性化合物水平較高，細(xì)胞持水力差，植株蒸騰作用強，無法進(jìn)行正常移栽。這種情況主要是由于培養(yǎng)容器中空氣濕度過高，透氣性較差造成的，其具體解決的方法為： ? ①增加培養(yǎng)基中的溶質(zhì)水平，以降低培養(yǎng)基的水勢； ? ②減少培養(yǎng)基中含氮化合物的用量； ? ③增加光照； ? ④增加容器通風(fēng)，最好進(jìn)行 CO2施肥，這對減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象有明顯的作用； ? ⑤降低培養(yǎng)溫度，進(jìn)行變溫培養(yǎng)，有助于減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生； ? ⑥降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素含量，可以考慮加入適量脫落酸。 3．生根培養(yǎng) ? 當(dāng)材料增殖到一定數(shù)量后 ， 就要使部分培養(yǎng)物分流到生根培養(yǎng)階段 。 若不能及時將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上去 ， 就會使久不轉(zhuǎn)移的苗子發(fā)黃老化 ，或因過分擁擠而使無效苗增多造成拋棄浪費 。 根培養(yǎng)是使無根苗生根的過程 ， 這個過程目的是使生出的不定根濃密而粗壯 。 生根培養(yǎng)可采用 1／ 2或者 1/4MS培養(yǎng)基 ， 全部去掉細(xì)胞分裂素 ， 并加入適量的生長素 (NAA、 IBA等 )。 誘導(dǎo)生根方法： ? ① 將新梢基部浸入 50或 100 106I IBA溶液中處理 4— 8h； ② 在含有生長素的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 46d； ③ 直接移入含有生長素的生根培養(yǎng)基中 。 上述三種方法均能誘導(dǎo)新梢生根 ， 但前二種方法對新生根的生長發(fā)育則更為有利 。 而第三種對幼根的生長有抑制作用 。其原因是當(dāng)根原始體形成后較高濃度生長素的繼續(xù)存在 ， 則不利于幼根的生長發(fā)育 。 不過這種方法比較可行 。 ? 另外也可采用下列方法就可生根：①延長在增殖培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時間；②有意降低一些增殖倍率，減少細(xì)胞分裂素的用量 (即將增殖與生根合并為一步 )；③切割粗壯的嫩枝在營養(yǎng)缽中直接生根，此方法則沒有生根階段?？梢允∪ヒ淮闻囵B(yǎng)基制作，切割下的插穗可用生長素溶液浸蘸處理，但這種方法只適于一些容易生根的作物。 ? 另外少數(shù)植物生根比較困難時，則需要在培養(yǎng)基中放置濾紙橋，使其略高于液面，靠濾紙的吸水性供應(yīng)水和營養(yǎng)，從而誘發(fā)生根。 ? 從胚狀體發(fā)育成的小苗 ， 常常有原先已分化的根 ， 這種根可以不經(jīng)