【文章內容簡介】 酸 +檸檬酸還原。 抗體的應用：檢測 ? RIA ? EIA ? ELISA ? 免疫熒光 ? 免疫組化 EIA 和 ELISA：抗原或抗體的檢測 競爭性 EIA 膠體金試紙條：定性檢測 電化學發(fā)光檢測（ ECILA） ＥＣＬＩＡ是利用電化學發(fā)光劑標記的抗原或 抗體與 待測物經過一系列的免疫反應和洗滌等理化 步驟 ，最后用光學儀器測量免疫反應前后 電化學發(fā)光信號 強度的改變，從而對抗原或抗體物質進行 定量分析 的一種 方法。 當反應體系中加入電子供體三丙 胺后 ，在電場作用下，釕分子和三丙胺在電極表面 分別被 氧化成三價釕和帶陽離子的自由基三丙胺。 后者很 不穩(wěn)定，迅速失去一個質子形成強還原劑 自由基三 丙胺，將三價釕分子還原成激發(fā)態(tài)的二價釕，其 自身 則被氧化成二丙胺和丙醛。接著激發(fā)態(tài)的釕分子 衰減成基態(tài)釕分子，同時放出一個波長為６２０ｎｍ 的光子。 這一過程在電極表面以每毫秒幾十萬 次的 速度循環(huán)進行，產生的光子經光電倍增管檢測 光強 度，從而測出待檢抗體或抗原的含量。 免疫 PCR PCR 免疫檢測方法 噬菌體免疫 PCR 組織切片與免疫組化（熒光） 冷凍切片 石蠟切片 10. 封片 FACS： florescence activated cell sorting MACS: magic activated cell sorting 蛋白質芯片的原理與檢測 1. 二抗檢測：顯色、熒光或發(fā)光。 2. 質譜檢測 不同水平的基因表達調控 microRNA Alternative splicing Histone acetylation and methylation DNA methylation 免疫共沉淀： CoIP ChIP：染色體免疫共沉淀 Western blot 抗體藥物：治療領域 ? 傳染性疾?。喊２├《? ? 自身免疫性疾?。侯愶L濕性關節(jié)炎 ? 腫瘤：乳腺癌、胃癌、結腸癌 作用機理： ? 代謝性疾?。汗琴|疏松、糖尿病。 抗病毒作用 自身免疫性疾病 腫瘤的治療： ADCC作用 腫瘤治療： CDC效應 腫瘤的血管新生 腫瘤自分泌生長因子 腫瘤的免疫檢查點 代謝性疾病的治療 抗體藥物的研發(fā) ? 選擇疾病類型 ? 選擇相關的抗原 ? 選擇研發(fā)的方向：仿制藥？創(chuàng)新藥？ ? 選擇抗體的來源：鼠源、人源。 ? 選擇抗體的表達方式：酵母？ CHO？轉基因植物？藻類細胞？人源細胞？ ? 選擇生產的工藝：不銹鋼？一次性袋子？ ? 選擇細胞培養(yǎng)的工藝：灌流？流加？ 發(fā)酵罐 WAVE 細胞培養(yǎng)的方式 灌流 流加 抗體的純化 抗體仿制藥的研發(fā) ? 文獻的調研：化合物專利、純化專利、制劑專利、組合物專利等。 ? 原 研藥的鑒定：氨基酸序列，原研藥的采購。 蛋白質的 N端測序 ? Edman化學降解，其基本原理是包括通過異硫氰酸苯脂與蛋白質和多肽的 N端殘基的偶聯(lián)，苯氨基硫甲酰酞（ PTC肽）環(huán)化裂解，和噻唑呤酮苯氨（ ATZ）轉化為苯異硫尿氨基酸（ PTH氨基酸）三個主要的化學步驟，每個循環(huán)從蛋白質與多肽裂解一個氨基酸殘基，同時暴露出新的游離的氨基酸進行下一個Edman降解，最后通過轉移的 PTH氨基酸鑒定實現蛋白質序列的測定。 高表達細胞株的構建： cell pool 高表達細胞株的構建：單克隆的篩選 抗體編碼 DNA序列的優(yōu)化原則 ? GC含量 ? 密碼子使用偏性 ? 隨機性 ? RNA的二級結構 ? 終止密碼子的選擇（雙終止密碼子） DNA的人工合成與序列分析 人基因組 DNA的 GC含量： 40% 抗體分子 DNA序列的優(yōu)化：密碼子偏性 抗體 DNA序列的優(yōu)化： RNA二級結構 表達載體的構建 GCCACCATGG Kozak translation initiation sequence 信號肽的選擇 抗體的分泌步驟 CHO細胞的 DNA轉染 1. 陽離子脂質體轉染方法 2. 電轉法 CHO細胞培養(yǎng) CD培養(yǎng)基的主要成分 The constituents of a chemically defined media include: a basal media (such as DMEM, F12, or RPMI 1640, containing amino acids, vitamins, inanic salts, buffers, antioxidants and energy sources), which is supplemented with rebinant albumin, chemically defined lipids, rebinant insulin and/or zinc, rebinant transferrin or iron, selenium and an antioxidant thiol such as 2mercaptoethanol or 1thioglycerol. 氨基酸 ? 氨基酸 氨基酸是組成蛋白質的基本單位。不同種類的細胞對氨基酸的要求各異，但有幾種氨基酸細胞自身不能合成，必須依靠培養(yǎng)液提供，這幾種氨 基酸稱為必需氨基酸。其中谷氨酰胺是細胞合成核酸和蛋白質必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時，細胞生長不良而死亡。因此，各種培養(yǎng)液中都有 較大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應置于 20℃ 冰箱中保存，在使用前加入培養(yǎng)液內。已含谷氨酰胺的培養(yǎng)液在 4℃ 冰 箱中儲存 2 周以上時，還應重新加入原來量的谷氨酰胺。 碳水化合物和無機鹽 ? 碳水化合物 碳水化合物 是細胞生長主要能量來源，其中有的是合成蛋白質和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉和醋酸等。 ? 無機鹽 培養(yǎng)液中無機鹽的主要功能是幫助細胞維持滲透壓平衡。此外，通過提供鈉，鉀和鈣離子，幫助細胞調節(jié)細胞膜功能。培養(yǎng)液的滲透壓是一個 非常重要的因素 , 細胞通常可耐受 260 mOsm/kg~320 mOsm/kg。標準培養(yǎng)液的滲透壓在此范圍內波動。特別注意：向培養(yǎng)液中加入其它物質 有可能會明顯改變培養(yǎng)液的滲透壓，特別是溶于強酸或強堿中的物質。向培養(yǎng)液中添加 HEPES 時 需調節(jié) 鈉離子濃度。 緩沖系統(tǒng)和維生素 ? 緩沖系統(tǒng) 大多數細胞所需 pH在 。但是，細胞培養(yǎng)最適 pH值隨培養(yǎng)的細胞種類不同而不同。成纖維細胞喜歡較高 pH （ ），而傳代轉化細胞 系則需要偏酸pH（ ）。由于多數培養(yǎng)液靠碳酸氫鈉（ NaHCO3）與 CO2體系進行緩沖，因此，氣相中的 CO2濃度應與培養(yǎng)液中碳酸氫鈉濃度相 平衡。如果氣相或培養(yǎng)箱空氣中 CO2濃度設定在 5％，培養(yǎng)液中 NaHCO3的加入量為 g/L；如果 CO2濃度維持在 10％，培養(yǎng)液中 NaHCO3的 加入量為 g/L。細胞培養(yǎng)瓶蓋不應擰得太緊，以保證氣體交換。 HEPES 是一種非離子緩沖液，在 pH 范圍內具有較好的緩沖能力，但是非常昂貴，在高濃度時對一些細胞可能有毒。 HEPES 緩沖液 可與低水平的碳酸鈉（ g/L）共用，以抵消因額外加入 HEPES 引起的滲透壓增加。在這種培養(yǎng)條件下，細胞培養(yǎng)瓶的蓋子應擰緊，以防止培 養(yǎng)液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。大多數培養(yǎng)液中含有酚紅作為 pH 指示劑，酸性培養(yǎng)液呈橙黃色，堿性培養(yǎng)液呈深紅色 。 ? 維生素 在 細胞培養(yǎng)中，盡管血清是維生素重要來源， 但是許多培養(yǎng)基中添加了各種維生素以適合更多的細胞系生長。 CHO細胞的培養(yǎng)工藝優(yōu)化 培養(yǎng)工藝的放大 溫度、攪拌轉速、 PH、溶氧、泡沫和液面水平。 培養(yǎng)工藝優(yōu)化和放大的 DOE軟件 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化