【文章內(nèi)容簡介】 細菌的接種根據(jù)待檢標本的來源、培養(yǎng)目的及所用培養(yǎng)基的性狀，采用不同的接種方法。l、平板畫線分離法（1） 、連續(xù)畫線分離法此法主要用于雜菌不多的標本。用接種環(huán)取標本少許，于平板 l/5 處密集涂布，然后回來作曲線連續(xù)劃線接種，線與線間有一定距離，劃滿平板為止。（2） 、分區(qū)畫線分離法此法適用于雜菌較多的標本。先將標本均勻涂布于平板邊緣一小區(qū) (約占平板 1/5)，再在二、三區(qū)依次連續(xù)畫線，每畫線一區(qū)均將接種針滅菌一次。每一區(qū)的劃線均接觸上一區(qū)的接種線 1～2 次。以獲得單個菌落。斜面接種法該法主要用于單個菌落的純培養(yǎng)。用滅菌接種針取菌少許，從培養(yǎng)基斜面底部向上劃一直線，然后從底部向上作連續(xù)曲線畫線。一直畫到斜面頂端。液體接種法多用于一些液體生化試驗管的接種。用滅菌接種環(huán)取菌少許，在試管內(nèi)壁與液面交接處的管壁上輕輕研磨，使細菌混合于液體中。穿刺接種法主要用于半固體培養(yǎng)基、明膠及雙糖鐵的接種。用接種針取菌少許，從半固體培養(yǎng)基中央，平行于管壁垂直刺入，接近管底但不可接觸管底，然后接種針原路退出。傾注平板法臨床上主要用于尿液等標本的細菌計數(shù)。將標本經(jīng)適當稀釋后，取一定量加入已滅菌的平皿內(nèi)，傾入已經(jīng)溶化并冷卻至 45℃左右的定量培養(yǎng)基，混勻，待凝固后倒置、培養(yǎng)。涂布接種法細菌室操作規(guī)程 細菌室操作程序文件18常用于紙片藥物敏感性測定，也可用于被檢標本的細菌計數(shù)。加定量的被檢菌液于瓊脂平板表面，然后用滅菌的棉簽反復涂布幾次，使被檢菌均勻分布在瓊脂平板表面。然后貼上藥敏紙片培養(yǎng)，或直接培養(yǎng)觀察結果。二、細菌培養(yǎng)方法根據(jù)臨床初步診斷及待檢細菌的種類，可選用不同的環(huán)境進行培養(yǎng)。常用的有需氧培養(yǎng)法、二氧化碳培養(yǎng)法和厭氧培養(yǎng)法。需氧培養(yǎng)法本法是臨床細菌室常用的培養(yǎng)方法，即將已經(jīng)接種好的平板、斜面和液體培養(yǎng)基等。置于 35℃溫箱中孵育 18～24 小時。二氧化碳培養(yǎng)法本室用 CO2 孵箱將已接種好的培養(yǎng)基置于 CO2 孵箱內(nèi)培養(yǎng)。三、分離及純化法、分離是指從原材料或多種細菌的混合培養(yǎng)物中將各種細菌彼此獨立地分離開，以得到純的單一菌株，技術步驟如下：作純培養(yǎng)分離時，一般只用一只完整的瓊脂平板。涂劃多采用分區(qū)劃線法，在一只平板中可劃 3～5 個區(qū)。劃法有兩種：、從臨床標本分離細菌所含菌數(shù)相對較少時，可用接種環(huán)取標本涂布在平板一角邊緣，然后從此區(qū)開始劃線至 1／3 平板，為第一區(qū)，再在 3 區(qū)依次劃線，每劃完一個區(qū)域均將接種環(huán)滅菌一次，冷卻后再劃下一區(qū)域，每一區(qū)域的劃線均接觸上一區(qū)域的接種線 1～2 次，使菌量逐漸減少以獲得單個菌落。、快速劃線分離法：采用快速劃線使一接種環(huán)標本能分離出單個菌落，這與標本的菌量及操作者的技能有很大關系。、純化是指欲獲得大量純培養(yǎng)物的方法，所用平板大小可根據(jù)需要的菌量而定。方法是將一單個菌落或?qū)⑾嗤木渥鞔罅棵芗縿澯谄桨迳隙@得大量純的培養(yǎng)物。細菌室操作規(guī)程 細菌室操作程序文件19支原體培養(yǎng)、鑒定及藥敏操作規(guī)程1．原理及依據(jù)標準：支原體分離鑒定培養(yǎng)基用于泌尿生殖道支原體(解脲支原體 Uu 和人型支原體 Mh)的檢測與診斷。當有 Uu 和 Mh 生長，分解尿素和精氨酸引起 PH 上升，使以酚紅為指示劑的培養(yǎng)基由黃轉紅。依據(jù)珠海迪爾生物工程有限公司生產(chǎn)的試劑盒說明書。2．標本的采集：、男性：用特別細的無菌棉拭子沾取無菌生理鹽水少許深入尿道口內(nèi)2～ 處取分泌物，前列腺液亦可用沾取無菌生理鹽水的無菌棉拭子盡量多的沾取。、女性：用沾取少許無菌生理鹽水的棉拭子取宮頸內(nèi)口 1～2cm 處單層柱狀上皮細胞，取樣拭子不可碰陰道壁。、支原體對干、熱抵抗力差，標本采集后應立即送檢。整個采樣過程應注意無菌操作。標本接種：(本實驗應注意無菌操作，避免污染雜菌)、取出培養(yǎng)基，放置接近室溫，并在瓶蓋上編號。、將采集的標本拭子插入培養(yǎng)瓶中，在靠近液面上方的瓶壁擠示壓旋轉拭子數(shù)次，使拭子中標本滲入到肉湯中：若為液體標本，取 200 u 1 加入培養(yǎng)基中；若為中段尿，經(jīng) 3000 轉／分離心 15 分鐘取沉渣 100ul 加入培養(yǎng)基中。、蓋上瓶蓋，置 35～37℃孵箱，在 24～48 小時分別觀察結果。結果判讀：培養(yǎng)基變紅，判斷陽性，培養(yǎng)基黃色并清亮，判斷陰性。已檢標本處理：密閉容器高壓滅菌后，按醫(yī)用垃圾處理。細菌室操作規(guī)程 細菌室操作程序文件20血液感染病原體檢驗操作規(guī)程標本采集(1)、采集時間和次數(shù)血標本一般應在病人發(fā)熱初期或根據(jù)不同的發(fā)熱情況在未用抗生素前采集做細菌培養(yǎng)，提高陽性率需連續(xù)三次采血進行培養(yǎng)。(2)、采血部位及抽血量一般抽取肘靜脈血。采血量為成人 5~10ml，兒童為3～5ml。(3)、結果觀察：培養(yǎng) 72 小時后若肉眼或自動血液培養(yǎng)儀報告仍未細菌生長，則盲目移種一次，仍未細菌生長，向臨床發(fā)出一級初級報告：“血液經(jīng) 72小時培養(yǎng)無細菌生長” ，為避免漏診，應在培養(yǎng) 5 天、7 天時再作盲目移種培養(yǎng)。疑為亞急性細菌性心內(nèi)膜炎、真菌血癥等時，血培養(yǎng)至少連續(xù)培養(yǎng) 2～3 周，仍無細菌生長方可報告為陰性。檢驗程序 血液標本（無菌采集）72h 盲目移種（初級報告）有細菌生長涂片、染色、鏡檢 需氧培養(yǎng)、CO2 培養(yǎng)直接藥敏試驗觀察菌落涂片、染色、鏡檢 純培養(yǎng)血清學鑒定、生化反應試驗、藥敏試驗確認報告初步報告細菌室操作規(guī)程 細菌室操作程序文件21血培養(yǎng)瓶中不同表現(xiàn)為不同細菌生長：渾濁并有凝無塊 均勻渾濁，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣 微渾濁，有綠色變化 表面有菌膜，培養(yǎng)基清晰，底層容血 表面有菌膜，膜下有綠色渾濁 血細胞層上面有顆粒狀生長，自上而下的溶血金黃色葡萄球菌多為革蘭陰性菌肺炎鏈球菌枯草桿菌銅綠假單胞菌溶血性鏈球菌 血液及骨髓標本中常見病原菌革蘭陽性菌 革蘭陰性菌肺炎鏈球菌 大腸埃希菌金黃色葡萄球菌 傷寒及其它沙門菌表皮葡萄球菌 變形桿菌溶血性鏈球菌 產(chǎn)氣腸桿菌糞腸球菌 肺炎克雷伯氏菌銅綠假單胞菌糞產(chǎn)鹼桿菌沙雷氏菌流感嗜血桿菌布魯氏菌報告結果血培養(yǎng)陽性均作為危急值報告，所以血培養(yǎng)的結果應及時通知臨床醫(yī)生，每日開始工作可以首先檢查血培養(yǎng)，如有細菌生長，立即處理。、疑有細菌生長者，經(jīng)涂片、革蘭氏染色、鏡檢后，電話通知主治醫(yī)生，報告“疑有革蘭氏菌生長” 。并做藥敏試驗，報告初步結果。、經(jīng)分純培養(yǎng)完成鑒定及藥敏試驗，發(fā)出報告。、培養(yǎng) 7 天仍為陰性的標本，報告無細菌生長。臨床上診斷為亞急性細菌性心內(nèi)膜炎者，可持續(xù)培養(yǎng)至兩周再發(fā)陰性報告。細菌室操作規(guī)程 細菌室操作程序文件22中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體檢驗操作規(guī)程l、標本采集 以無菌方法采集腦脊液 2～5ml，盛于無菌瓶中送檢。直接檢查 腦脊液可直接涂片、革蘭染色或抗酸染色等，然后鏡檢。無色透明的腦脊液，應作離心取沉淀物涂片、染色鏡檢。檢驗步驟：、一般細菌涂片檢查除結核性腦膜炎外，由其它細菌引起的化膿性腦膜炎，腦脊液明顯混濁，可直接涂片，革蘭染色鏡檢。無色透明的腦脊液，應離心后涂片、染色、鏡檢，根據(jù)染色及形態(tài)特征可初步提示細菌的種類。結核分枝桿菌涂片檢查：取腦脊液的離心沉淀物(3000r／min。30min)作抗酸染色。新型隱球菌涂片檢查：取腦脊液的離心沉淀物作墨汁負染色。、分離培養(yǎng)用接種環(huán)挑取混濁腦脊液或經(jīng)離心沉淀的沉淀物，分別接種于血平板、巧克力平板，巧克力平板應置于 CO2 環(huán)境中 35℃培養(yǎng) 18～24 小時。腦脊液也可直接注入血培養(yǎng)瓶。檢驗程序生化鑒定、血清學鑒定藥敏試驗報告初步報告結核分枝桿菌新生隱球菌等一般細菌腦膜炎奈瑟菌抗酸染色革蘭染色動力試驗墨汁染色沙氏培養(yǎng)基、血平板血平板、巧克力平板（5%CO2 環(huán)境）染色標本不染色標本分離培養(yǎng)直接涂片（取離心沉淀）腦脊液一般細菌腦膜炎奈瑟菌細菌室操作規(guī)程 細菌室操作程序文件23腦脊液培養(yǎng)常見病原菌革蘭陽性菌 革蘭陰性菌金黃色葡萄球菌 腦膜炎奈瑟菌 A、B 群鏈球菌 卡他布蘭漢菌 肺炎鏈球菌 流感嗜血桿菌 結核分支桿菌 腸桿菌科菌種 產(chǎn)單核李斯特菌 腦膜敗血性黃桿菌 新型隱球菌 假單胞菌 白色念珠菌報告結果無論是涂片還是培養(yǎng)，一但見到陽性菌應立即通知臨床醫(yī)師。培養(yǎng)并經(jīng)鑒定的結果報告“菌” ，同時報告藥敏試驗結果。細菌室操作規(guī)程 細菌室操作程序文件24下呼吸道感染病原體檢驗操作規(guī)程標本的采集有自然咳痰法、咽拭子采集法、支氣管鏡下采集法及分泌物標本。標本的直接檢查(1)、將痰標本涂片后待干，固定、染色，或直接濕片鏡檢，對病原學早期、初步診斷有重要意義。并向臨床發(fā)出初級報告。(2)、一般認為合格的痰標本為：以白細胞≥25 個/ 低倍鏡視野，而上皮細胞≤10 個/低倍鏡視野。采集合格標本對細菌的診斷尤為重要。分離培養(yǎng)與鑒定(1)、一般要求下呼吸道感染培養(yǎng)的細菌濃度應10 7CFU/ml，可視為病原菌，104CFU/ml 可視為污染菌。若介于兩者之間 105～ 106CFU／ml 時，要連續(xù)分離培養(yǎng)兩次以上仍為 105～10 6CFU／ml 時，亦認為是病原菌。(2)、檢驗程序分離培養(yǎng)血平板、麥康凱平板涂片、染色、鏡檢痰液及下呼吸道分泌物報告鑒定試驗、藥敏試驗純培養(yǎng)細菌菌落觀察初步報告涂片、染色、鏡檢細菌室操作規(guī)程 細菌室操作程序文件25下呼吸道標本培養(yǎng)常見病原菌革蘭陽性菌 革蘭陰性菌金黃色葡萄球菌 腦膜炎奈瑟氏菌 化膿性鏈球菌 流感嗜血桿菌 肺炎鏈球菌 腸桿菌科細菌 結核分支桿菌 非發(fā)酵菌 白喉棒狀桿菌 嗜肺軍團菌 假絲酵母菌報告結果痰中的病原菌不少屬于機會致病菌，與正常菌群同時存在，報告時應作說明，未檢出致病菌時，應報告“無致病細菌生長” 。細菌室操作規(guī)程 細菌室操作程序文件26尿路感染病原體檢驗操作規(guī)程尿液培養(yǎng)常見病原菌革蘭陽性菌 革蘭陰性菌金黃色葡萄球菌 淋病奈瑟菌 腸球菌 大腸埃希菌 A 群鏈球菌 變形桿菌 腐生葡萄球菌 肺炎克雷伯菌 表皮葡萄球菌 產(chǎn)氣腸桿菌 結核分支桿菌 沙門菌種 銅綠假單胞菌 沙雷菌標本收集、尿液標本的采集可采用多種方法：有中段尿采集法、膀胱穿刺法、腎盂尿采集法，而常規(guī)是取中段尿作細菌培養(yǎng)。、取中段尿作培養(yǎng)時先要進行前尿道的清洗消毒，以免前尿道寄生菌群污染標本。、如采用其他方法收集標本，必須由臨床醫(yī)生根據(jù)臨床診斷需要而執(zhí)行收集術，并在檢驗單上寫明。檢驗步驟、涂片檢查、一般細菌及淋病奈瑟菌涂片：以無菌操作吸取尿液 10ml，3000r/min離心 15min，去上清液，取沉淀涂片，革蘭氏染色鏡檢，作初步報告。如查見革蘭氏陰性雙球菌，呈腎形位于細胞內(nèi)或細胞外，報告“找到革蘭陰性雙球菌，存在于細胞內(nèi)外，形似淋病奈瑟菌” 。如未查見上述細菌可報告“未發(fā)現(xiàn)革蘭陰性雙球菌” 。、念珠菌涂片：取尿液