動(dòng)物免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)(編輯修改稿)
2024-09-01 03:16 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 血清中的相應(yīng)抗體和滴定抗體的含量。 [目的要求]掌握病毒HA和HI試驗(yàn)的原理和基本操作方法，了解其實(shí)用價(jià)值。[材料與試劑]1. 96孔“U”形或“V”形微量反應(yīng)板，50mL定量移液器，滴頭，微型振蕩器。2. 生理鹽水，% 雞紅細(xì)胞懸液。3. 新城疫病毒液（尿囊液或凍干疫苗液），新城疫陽(yáng)性血清，被檢雞血清。[實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及操作方法]（一）血球凝集(HA)試驗(yàn) 1. 在96孔微量反應(yīng)板上進(jìn)行，自左至右各孔加50mL生理鹽水。2. 于左側(cè)第1孔加50mL病毒液（尿囊液或凍干疫苗液），混合均勻后，吸50mL至第2孔，依次倍比稀釋至第11孔，吸棄50mL；第12孔為紅細(xì)胞對(duì)照。3. % 雞紅細(xì)胞懸液50mL，在振蕩器上振蕩，室溫下靜置后觀察結(jié)果（表41）。表 41 病毒血凝試驗(yàn)的操作方法（單位：mL）孔 號(hào)123456789101112病毒稀釋度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048對(duì)照生理鹽水505050505050505050505050病毒液5050505050505050505050 %紅細(xì)胞505050505050505050505050棄50結(jié)果觀察+++++++++++++++++++++++++++++++++ 4. 結(jié)果判定：從靜置后10 min開(kāi)始觀察結(jié)果，待對(duì)照孔紅細(xì)胞已沉淀即可進(jìn)行結(jié)果觀察。紅細(xì)胞全部凝集，沉于孔底，平鋪呈網(wǎng)狀，即為100% 凝集（++++），不凝集者（）紅細(xì)胞沉于孔底呈點(diǎn)狀。以100% 凝集的病毒最大稀釋度為該病毒血凝價(jià)，即為一個(gè)凝集單位。從表41看出，該新城疫病毒液的血凝價(jià)為1:128，則l:128為1個(gè)血凝單位，1:6l:32分別為4個(gè)血凝單位，或?qū)?28/4=32，即1:32稀釋的病毒液為4個(gè)血凝單位。(二) 血球凝集抑制(HI)試驗(yàn) 1. 根據(jù)HA試驗(yàn)結(jié)果，確定病毒的血凝價(jià)，配制出4個(gè)血凝單位的病毒液。2. 在96孔微量反應(yīng)板上進(jìn)行，用固定病毒稀釋血清的方法，自第1孔至第11孔各加50mL生理鹽水。3. 第１孔加被檢雞血清50mL，吹吸混合均勻，吸50mL至第2孔，依此倍比稀釋至第10孔，吸棄50mL，稀釋度分別為：1:２、1:1:8 …… ；第12孔加新城疫陽(yáng)性血清50mL，作為血清對(duì)照。4. 自第1孔至12孔各加50mL 4個(gè)血凝單位的新城疫病毒液，其中第11孔為4單位新城疫病毒液對(duì)照，振蕩混合均勻，置室溫中作用10min 。5. % 雞紅細(xì)胞懸液50mL，振蕩混合均勻，室溫下靜置后觀察結(jié)果（表42）。表42 病毒血凝抑制試驗(yàn)的操作方法（單位：mL）孔 號(hào)123456789101112血清稀釋度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:1024病毒對(duì)照血清對(duì)照生理鹽水5050505050505050505050被檢雞血清50505050505050505050504單位病毒505050505050505050505050室溫中靜置 10 min%紅細(xì)胞505050505050505050505050棄去50 結(jié)果觀察++++++++++++++6. 結(jié)果判定：待病毒對(duì)照孔（第11孔）出現(xiàn)紅細(xì)胞100%凝集（++++），而血清對(duì)照孔（第12孔）為完全不凝集（）時(shí)，即可進(jìn)行結(jié)果觀察。以100％抑制凝集（完全不凝集）的被檢血清最大稀釋度為該血清的血凝抑制效價(jià)，即HI效價(jià)。凡被已知新城疫陽(yáng)性血清抑制血凝者，該病毒為新城疫病毒。從表42看出，該血清的HI效價(jià)為1:64，用以2為底的負(fù)對(duì)數(shù)(log2)表示，即6log2。附 錄1. 阿氏液（Alsever）：即紅細(xì)胞保養(yǎng)液枸櫞酸鈉（5H2O） 枸櫞酸（H2O） 葡萄糖 氯化鈉 雙蒸水 加至 100 ml 將以上試劑加熱溶解于雙蒸水中，115℃滅菌10min,4℃保存?zhèn)溆谩?. % 雞紅細(xì)胞制備方法% 枸櫞酸鈉溶液(其量為所需血量的1／5)，從雞翅靜脈或心臟采血至需要血量，置滅菌離心管內(nèi)，加滅菌生理鹽水為抗凝血的2倍，以2000r/min離心10min，棄上清液，再加生理鹽水懸浮血球，同上法離心沉淀，如此將紅細(xì)胞洗滌三次，最后根據(jù)所需用量，% 雞紅細(xì)胞懸液。3. 96孔微量反應(yīng)板的清洗將浸泡有75% 乙醇的棉簽放入微量反應(yīng)板的每個(gè)孔內(nèi)旋轉(zhuǎn)，用自來(lái)水沖洗反應(yīng)板5次，再用蒸餾水沖洗3次以上，置37℃溫箱中干燥。[思考題]1. HA和HI試驗(yàn)的原理是什么？2. HI試驗(yàn)是不是特異的抗原抗體反應(yīng)，為什么?3. HA和HI試驗(yàn)有何實(shí)際應(yīng)用意義？實(shí)驗(yàn)五 E玫瑰花環(huán)試驗(yàn)動(dòng)物的T淋巴細(xì)胞具有結(jié)合紅細(xì)胞的性質(zhì)，其分子基礎(chǔ)是T細(xì)胞表面存在CD2分子，也就是紅細(xì)胞受體，多數(shù)動(dòng)物的T細(xì)胞是綿羊紅細(xì)胞受體，而豚鼠、馬的T細(xì)胞是家兔紅細(xì)胞受體，因此紅細(xì)胞能粘附到T細(xì)胞周?chē)纬梢欢涿倒寤拥幕ōh(huán)，故取名為E玫瑰花環(huán)（erythrocyte rosettes），即紅細(xì)胞玫瑰花環(huán)，該試驗(yàn)稱(chēng)為E玫瑰花環(huán)試驗(yàn)（erythrocyte rosettes assay）。凡能與紅細(xì)胞形成E玫瑰花環(huán)的淋巴細(xì)胞簡(jiǎn)稱(chēng)為E花環(huán)形成細(xì)胞。該試驗(yàn)可用于計(jì)數(shù)或分離E花環(huán)形成細(xì)胞以及測(cè)定機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)。[目的要求] 1. 掌握E玫瑰花環(huán)試驗(yàn)的原理及操作方法。2. 熟悉淋巴細(xì)胞的分離方法。[材料與試劑]1. 試管，離心管，毛細(xì)管，吸管，注射器，載玻片，血球計(jì)數(shù)板，豚鼠，家兔等。2. 淋巴細(xì)胞分層液，無(wú)鈣、鎂的Hank’s液，肝素液，小牛血清。 3. % 戊二醛溶液：25% ，Hank’ ml，用前配制。4. GiemsaWeight 染色液：Ⅰ液： ml ，研磨混勻；Ⅱ液： ml 中，置60℃溫箱，最后加甲醇33 ml 即可；使用時(shí)，分別將Ⅰ液和Ⅱ。[實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及操作方法](一) 豚鼠淋巴細(xì)胞的制備1. 方法1取豚鼠肝素抗凝血3 ml，沿離心管壁輕輕地加入到 3 ml 的淋巴細(xì)胞分層液的上面，使二層液體的界面不相混合；于水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)中，2000r/min離心20min，離心后分為四層，上層為血漿，此層與分層液液面交界處有一云霧狀層，即為淋巴細(xì)胞層，云霧狀層之下為淋巴細(xì)胞分層液，底層主要為紅細(xì)胞，用毛細(xì)管輕輕地把淋巴細(xì)胞層吸入另一試管中；用5倍Hank’s 液反復(fù)洗滌淋巴細(xì)胞2次，每次2000r/min 離心10min；若第一次離心后，沉淀的淋巴細(xì)胞中有少量紅細(xì)胞，可加蒸餾水l ml 左右，振搖1min，使紅細(xì)胞破裂，然后立即加Hank’s液4 ml 左右，混勻，2000r/min 離心10min，棄上清液，繼續(xù)用Hank’s液洗滌一次；沉淀的淋巴細(xì)胞用Hank’s液配成細(xì)胞數(shù)為5106個(gè)/ml的懸液。2. 方法2取豚鼠肝素抗凝血2 ml ，加等量Hank’s 液混合，沿離心管壁用毛細(xì)管緩緩加于2ml淋巴細(xì)胞分層液表面，置水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)，2000r/min離心20min，用毛細(xì)管吸取血漿與分層液之間的乳白色淋巴細(xì)胞層，以Hank’s 液如上洗滌，再以Hank’s液配成細(xì)胞數(shù)為5106個(gè)/ml的懸液。3. 方法3 取豚鼠肝素抗凝血2 ml ，置37℃水浴中靜置3040min，吸取上層白細(xì)胞與血漿的混合液（約1 ml）；于混合液中加Hank’s液數(shù)毫升，1500r/min離心510 min，棄上清，重復(fù)用Hank’s液洗滌4次，沉淀均勻即為淋巴細(xì)胞懸液。 (二) 家兔紅細(xì)胞（RRBC）的制備1. 心臟采集家兔肝素抗凝血5 ml ，以2000r/min離心10min，棄上清液。2. 用Hank’s液反復(fù)洗滌紅細(xì)胞三次，每次2000r/min離心10min ，再以Hank’s液配成10% RRBC懸液。（三）E花環(huán)形成細(xì)胞1. ml 淋巴細(xì)胞懸液，加10% ml ， ml 。2. 37℃水浴15min，600r/min離心5min，吸棄上
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