凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(編輯修改稿)
2025-09-01 02:51 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 或者讓冷探針優(yōu)先反應(yīng)。然后加入標(biāo)記好的探針，混勻，室溫(2025℃)放置20分鐘。 3. 加入1微升EMSA/GelShift上樣緩沖液(無(wú)色，10X)，混勻后立即上樣。注意：有些時(shí)候溴酚藍(lán)會(huì)影響蛋白和DNA的結(jié)合，建 議盡量使用無(wú)色的EMSA/GelShift上樣緩沖液。如果對(duì)于使用無(wú)色上樣緩沖液在上樣時(shí)感覺到無(wú)法上樣，可以在無(wú)色上樣緩沖液里面添加極少量的藍(lán)色的上樣緩沖液，至能觀察到藍(lán)顏色即可。 五、 電泳分析 。按照10V/厘米的電壓預(yù)電泳10分鐘。預(yù)電泳的時(shí)候如果有空余的上樣孔，可以加入少量稀釋好的1X 的EMSA上樣緩沖液(藍(lán)色)，以觀察電壓是否正常進(jìn)行。 。在多余的某個(gè)上樣孔內(nèi)加入10微升稀釋好的1X的EMSA/GelShift上樣緩沖液 (藍(lán)色)，用于觀察電泳進(jìn)行的情況。 V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過30℃，如果溫度升高，需要適當(dāng)降低電壓。電泳至EMSA/GelShift上樣緩 沖液中的藍(lán)色染料溴酚藍(lán)至膠的下緣1/4處，停止電泳。小心取下夾有EMSA膠的膠板，用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊 緣的電壓液。小心打開兩塊膠板中的上面一塊(注：通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板)，把濾紙從EMSA膠的一側(cè)逐漸覆蓋住整個(gè)EMSA膠，輕輕把濾紙和膠壓緊。濾紙被膠微微浸濕后(大約不足1分鐘)，輕輕揭起濾紙，這時(shí)EMSA膠會(huì)被濾紙一起揭起來。把濾紙側(cè)向下，放平，在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜，確保保鮮膜和膠之間沒有氣泡。然后用X光片壓片檢測(cè)，或用其它適當(dāng)儀器設(shè)備檢測(cè)。EMSA實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素：用藥品刺激細(xì)胞時(shí),設(shè)計(jì)的藥品濃度和時(shí)間梯度的問題,這個(gè)很關(guān)鍵！總結(jié)建議:一是受體結(jié)合類的直接刺激激活信號(hào)通路的方法，一般達(dá)到EMSA核轉(zhuǎn)運(yùn)高峰的時(shí)間比較短，大概控制在30min2h之間，很多時(shí)候都是在45min和1h達(dá)到高峰，當(dāng)然還有合適的濃度！二是用藥物刺激產(chǎn)生受體可能
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