凝膠過濾ppt課件(編輯修改稿)
2025-06-02 07:55 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 分子質(zhì)量 小 的物質(zhì)則 后 從柱中流出。 (見圖 62) 流出物分管 等量 或 等時(shí) 地 收集 ， 檢測(cè) 后 分段 合并 相同組分 的各管流出物，把分子質(zhì)量不同的物質(zhì)相互 篩分開 了。 ? 篩分效果 受操作條件的影響 (如基質(zhì)的顆粒大小、均勻度、篩孔直徑和床體積的大小、洗脫液的流速以及樣品的種類等 )； 更為直接的影響是 Kav值 的差異性。 Kav值 差異性 大 ， 分離效果 好 ； Kav值差異性 小 ，乃至等于 1或等于零 (即使樣品中各組分的分子質(zhì)量相差很大 )，則分離效果 很差 ，或根本不能分開。 ? Kav值的計(jì)算 從公式 Kav=（ VeVo） /（ VtVo） 看出 ， 只要測(cè)出：床體積 Vt 外水體積 Vo 洗脫體積 Ve 即可計(jì)算出 Kav值 。 ? 凝膠床總體積 Vt的求得 有如下 2種方法可求得 Vt 根據(jù)層析柱體積計(jì)算總體積 ， 可用下列公式表示 Vt =πr2h 式中 , r為層析柱半徑； h為凝膠床高度； π為圓周率 。 已知 ， 床體積 Vt Vt=Vo+Vi+Vg 因 Vg與 Vt相比是很小的 ， 可忽略不計(jì) ， 故 Vt=Vo+Vi Vo和 Vi可以通過 實(shí)驗(yàn) 測(cè)得 (見圖 63)， 如下： 通過實(shí)驗(yàn)求 Vo和 Vi 當(dāng)把 分子質(zhì)量不同 的 混合溶液 鋪在凝膠床上時(shí) ， 溶液中的 分子大于凝膠孔徑上限者 ， 不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔內(nèi) ， 而被排阻在外水體積的溶液中 。 凝膠床的洗脫體積 Ve剛好等于 外水體積 Vo， 即 : Ve=Vo (Kav=0) 溶液中的分子 小于 凝膠孔徑 下限者 ， 能自由進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔內(nèi)； 凝膠床的洗脫體積 Ve應(yīng)等于 凝膠床總體積 , 即 : Ve=Vt=Vo+Vi (Kav=1) 則 : Vi=VeVo 溶液中的分子大小 介于 凝膠孔徑上限和下限 之間者 ， 則有一部分能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔 ， 故其洗脫體積 Ve是在 Vo和 Vt之間 (Kav在 0～ 1之間 )。 實(shí)踐中 測(cè)定外水體積 （ Vo） 通常選用 藍(lán)色葡聚糖 2022作為測(cè)定外水體積的物質(zhì) 。 理由是： 該 物質(zhì) 分子質(zhì)量 大 (為 200萬 )， 呈 藍(lán)色 ， 在各種型號(hào)的葡聚糖凝膠中都被完全排阻 ， 并可借助本身的顏色 ， 采用 肉眼 或分光光度計(jì)檢測(cè) (在 210nm或260nm、 620nm)洗脫體積 Ve， 即 Ve = Vo 測(cè)定內(nèi)水體積 (Vi) 可選用 硫酸銨 、 N— 乙酰酪氨酸乙酯 ， 或者其他與凝膠無吸附力的 小分子物質(zhì) 。 即： Vi = Ve Vo ? 洗脫體積 Ve 分子大小 介于 凝膠孔徑上限和下限 之間者 的洗脫體積Ve也是通過實(shí)驗(yàn)測(cè)得 。 故可求得某一分離物的 Kav值 =（ VeVo） /（ VtVo） 。 分離物在凝膠過濾層析時(shí)的行為 ， 除用 Kav和 Kd表示外 ，還可用 Ve／ Vo或 Vo／ Ve(R值 )表示 。 這些值的大小見圖63。 第三節(jié) 操 作 一 、 凝膠的選擇和處理 1． 凝膠的選擇 ? (1)型號(hào) ? 凝膠型號(hào)多 。 型號(hào)不同 ， 篩分范圍 亦不相同 。 Sephadex G型一般適宜于分離蛋白質(zhì)。 ? 蛋白質(zhì)脫鹽時(shí)，可選用凝膠 SephadexG25。 ? 一般來說， 在規(guī)定的篩分范圍內(nèi)，混合物之間 分子質(zhì)量 差別越大 ，分離的效果 越好 。 ? (2)粒度 ? 凝膠的粒度有粗有細(xì) (與交聯(lián)度無關(guān) )。 ? 細(xì)顆粒凝膠之間空間小 ， 裝柱 易均一 ， 因此分 離效果較粗得 好 (見圖 64)。 但 細(xì)顆粒 凝膠 流速慢 ， 故宜 用 大直徑 的層析柱 ， 這類凝膠用于小型試驗(yàn) ， 可得到滿意結(jié)果 。 粗顆粒 凝膠 流速快 ， 宜用于 小直徑 的層析柱 ， 如操作得當(dāng)也可得到較滿意的結(jié)果 。 2． 凝膠用量的計(jì)算 ? 根據(jù)層析柱的 體積 和干凝膠的 膨脹度 (見表 62)，按下面的公式可計(jì)算出所需干凝膠的用量： 干凝膠用量（ g） =πr2h / 膨脹度 膨脹度 =床體積 /g ? 用此法計(jì)算出的干凝膠用量還需增加 10％ ~20％ ，因?yàn)槟z在處理過程中會(huì)有一部分損失。 3． 凝膠的處理 ? 將所用的干凝膠慢慢傾人 5~10倍的蒸餾水中 ， （ 參照表 62凝膠溶脹所需的時(shí)間 ） 進(jìn)行充分浸泡 ? 然后用傾斜法除去表面懸浮的小顆粒 ? 再用 ／ L ／ L NaCl溶液在室溫下浸泡 ? 以抽濾法除去堿液
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