【文章內(nèi)容簡介】 胞膜通透性，而且毒性小對細胞有保護作用。甘油的使用濃度依不同組織而定，一般在 5％ 20％之間。 DMSO比甘油更能防止細胞凍傷，通透性更高，黏度更低，毒性更小。細胞在 DMSO中30s10min即可達到內(nèi)外平衡。 DMSO常用濃度為 5％ ％，使用時應(yīng)注意 DMSO的質(zhì)量，要用蒸汽高壓消毒。復(fù)蘇時含 0． 5%1％ DMSO不影響細胞生長。 32 ③ 凍結(jié)方法 準備傳代的單層細胞可進行凍存。操作方法是用常規(guī)方法消化分散細胞，離心收集 (800r／ min)，按每毫升 5X106個細胞濃度添加保護劑 (保護劑是在生長液中加入 8%10%DMSO、 15％ 20％牛血清及適量 NaHC03配成，也可添加適量抗生素 )，然后以 1mL量分裝于 2mL的保存瓶中，在 04℃ 預(yù)凍 24h，搖勻，置于 70℃ 冰箱凍存。也可先置于液氮罐氣相中過夜，再浸入液相中 (196℃ )保存?；?qū)?70℃ 凍存過夜的細胞保存瓶直接浸入液氮中存放。 33 ④ 凍存細胞的復(fù)蘇 細胞傳代培養(yǎng)前，要先使凍存細胞融化復(fù)蘇。其過程為取出凍存細胞保存瓶，立即用 4層紗布包好。浸入 40℃ 水中片刻，防止炸裂，去掉紗布，浸入水中搖融 40s，混勻后立刻接種到 12個培養(yǎng)瓶中，按等量稀釋法加人生長液使成為 20mL。如用 DMSO為保護劑即可直接接種，但 DMSO必須在生長液中被稀釋 10倍以上。若保護劑是甘油，即應(yīng)離心收集細胞，除去甘油后再接種。加完生長培養(yǎng)液后，取樣計活細胞數(shù)，用臺酚藍染色，死者為藍色。于 37℃ 培養(yǎng) 418h后換液，然后轉(zhuǎn)入傳代培養(yǎng)。 34 二、生物材料的預(yù)處理 (一 )組織與細胞的破碎 1．物理法 (1)磨切法 工業(yè)上常用的有絞肉機、刨胰機、膠體磨、 球磨機、萬能磨粉機。實驗室常用的有勻漿 器、乳缽、高速組織搗碎機。用乳缽時，常 加入玻璃粉、氧化鋁等助磨劑。 35 (2)壓力法 有滲透壓法，高壓法和減壓法。高壓法是用幾百萬至幾千萬壓力反復(fù)沖擊物料。減壓法是對菌體緩緩加壓，使氣體溶入細胞，然后迅速減壓使細胞破裂。滲透壓法是使細胞在濃鹽中平衡，再投入水中膨脹破裂。 (3)震蕩法 用超聲波震蕩破碎細菌細胞，頻率為 10一 200kHz。該法產(chǎn)熱較多，要注意冷卻。 36 (4)凍融法 將材料先在一 15℃ 以下凍結(jié)，再使其融化，反復(fù)操作使細胞與菌體破碎。 用稀酸、稀堿、濃鹽、有機溶劑或表面活性劑 (如膽酸鹽、氧化十二烷基吡啶 )處理細胞，可使細胞結(jié)構(gòu)破壞，釋放出內(nèi)容物。 37 3．生物法 (1)組織自溶法 利用組織中自身酶的作用，改變、破壞細胞結(jié)構(gòu)，釋放出目的物，稱為組織自溶。自溶過程酶原被激活為酶，既便于提取，又提高了效率，但不適用于易受酶降解的目的物的提取。 38 (2)酶解法 用外來酶處理生物材料，如用溶菌酶處理某些細菌，用胰酶處理豬腦生產(chǎn)腦安泰等。用作專一性分解細胞壁的酶還有細菌蛋白酶、纖維素酶、蝸牛酶、酯酶、殼聚糖 (3)噬菌體法 用噬菌體感染細菌、裂解細胞，釋放出內(nèi)容物。此法較少應(yīng)用。 39 (二 )細胞器的分離 為獲得結(jié)合在細胞器上的一些生化成分或酶系，常常要先獲得特定的細胞器，再進一步分離目的產(chǎn)物。方法是勻漿破碎細胞，離心分離，包括差迷離心和密度梯度離心?，F(xiàn)以大鼠肝細胞勻漿的差迷離心分離各種細胞器為例加以說明，見圖 9— 1。 40 41 對所得細胞器的含量與純度可用電鏡觀察，用免疫法分析某種特定物質(zhì)的含量或用“標志酶”法分析特定酶類的濃度予以確定。如線粒體可測定琥珀酸脫氫酶，微粒體可測定 NADPH(輔酶 Ⅱ )細胞色素 C還原酶，細胞膜可測定 Na、 KATP酶，細胞核可測定 DNA合成酶。 42 (三 )制備丙酮粉 在生化物質(zhì)提取前，有時還有用丙酮處理原材料，制成“丙酮粉”，其作用是使材料脫水、脫脂，使細胞結(jié)構(gòu)松散，增加了某些物質(zhì)的穩(wěn)定性，有利于提取，同時又減少了體積，便于貯存和運輸。而且應(yīng)用“丙酮粉”提取可以減少提取液的乳化程度及黏度，有利于離心與過濾操作。同時，有機溶劑既能抑制微生物的生長和某些酶的作用，防止目的物降解失活，又能阻止大量無關(guān)蛋白質(zhì)的溶出，有利于進一步純化。 43 三、生物活性物質(zhì)的提取 提取是利用制備目的物的溶解特性，將目的物與細胞的固形成分或其他結(jié)合成分分離，使其由固相轉(zhuǎn)入液相或從細胞內(nèi)的生理狀態(tài)轉(zhuǎn)入特定溶液環(huán)境的過程。生物活性物質(zhì)的提取常用浸漬法 (用冷溶劑溶出固體材料中的物質(zhì) )與浸煮法 (用熱溶劑溶出目的物 )。 44 (一 )提取方法的選擇及注意的問題 提取是分離純化活性物質(zhì)的第一步，其目的和作用是除去與目的物性質(zhì)差異大的雜質(zhì)，濃縮目的物。要獲得好的提取效果，最重要的是針對生物材料和目的物的性質(zhì)選擇合適的溶劑系統(tǒng)與提取條件。常用的提取方法是固液提取，常用的溶劑是水。生物材料和目的物與提取有關(guān)的一些性狀包括目的產(chǎn)物的溶解性質(zhì)、相對分子質(zhì)量、等電點、存在方式、穩(wěn)定性、相對密度、粒度、黏度、含量、主要雜質(zhì)種類及性質(zhì)、相關(guān)酶類的特性等。其中最主要的是目的物與主要雜質(zhì)在溶解度方面的差異以及它們的穩(wěn)定性。設(shè)計者可根據(jù)文獻資料及試驗結(jié)果獲得有關(guān)信息，選擇、設(shè)計合適的方法和條件。 45 在提取過程中盡量增加目的物的溶出度、減少雜質(zhì)的溶出度，同時關(guān)注生物材料及目的物在提取過程中的活性變化。對酶類藥物的提取要防止輔酶的丟失和其他失活因素的干擾；對蛋白質(zhì)類藥物要防止其高級結(jié)構(gòu)的破壞，應(yīng)避免高熱、強烈攪拌、大量泡沫、強酸、強堿及重金屬離子等不利因素對其空間構(gòu)象的影響；多肽類及核酸類藥物需注意避免酶的降解作用，并添加某些酶抑制劑；對脂類藥物應(yīng)特別注意防止氧化，減少與空氣接觸等措施，如添加抗氧劑、通氮氣及避光等。提取過程，應(yīng)在低溫、無菌條件下進行。 46 水是提取生化物質(zhì)的常用溶劑。水是高度極化的極性分子，具有很高的介電常數(shù)。在水溶液中，水分子自身形成氫鍵的趨勢很強，有極高的分子內(nèi)聚力 (締合力 )。水分子的存在可使其他生物分子間 (包括同種分子與異種分子 )的氫鍵減弱，而與水分子形成氫鍵，水分子還能使溶質(zhì)分子的離子鍵解離，這就是所謂“水合作用”。水合作用促使蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子與水形成了水合分子或水合離子；從而促使它們?nèi)芙庥谒蛩芤褐小? 47 (二 )活性物質(zhì)的保護措施 在提取過程中，保持目的物的生物活性十分重要，對于一些生物大分子，如蛋白質(zhì)、酶及核酸類藥物常采用下列保護措施。 (1)采用緩沖系統(tǒng) 提取溶劑采用緩沖系統(tǒng)，防止提取過程中某些酸堿基團的解離導(dǎo)致溶液 pH值的大幅度變化，使某些活性物質(zhì)變性失活，或因 pH值變化影響提取效果。在生化藥物制備中，常用的緩沖系統(tǒng)有磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、 tris緩沖液、醋酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液和巴比妥緩沖液等，所使用的緩沖液濃度較低，以利于增加溶質(zhì)的溶解性能。