【文章內(nèi)容簡介】 因槍直接導(dǎo)入機(jī)體細(xì)胞，使外源基因通過機(jī)體內(nèi)源性表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并提呈給免疫系統(tǒng)，從而誘發(fā)產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答。核酸疫苗是近年來新興的一種疫苗，目前正處于試驗研究階段，因其免疫保護(hù)效率低及其他一些尚未克服的困難存在，其實際應(yīng)用尚需時日。5． 存在的問題 禽流感的預(yù)防主要仍賴于疫苗，綜合國內(nèi)外的研究，從目前來看，無論是滅活疫苗還是活疫苗均存在以下幾點問題； 首先，AIV的15種HA亞型均可造成禽流感暴發(fā)。雖然歷史上造成嚴(yán)重?fù)p失的都是H5或H7亞型，但每一次暴發(fā)至少15種可能亞型均需考慮，預(yù)防免疫須由病原分離和鑒定結(jié)果來確定，盲目用苗可能起不到預(yù)防免疫的效果。 其次，疫苗的使用，將代替?zhèn)鹘y(tǒng)的封鎖、撲殺、凈化、控制和撲滅禽流感，但接踵而來的是沒有癥狀的病禽或感染的禽肉將進(jìn)入商業(yè)貿(mào)易，會使地區(qū)與地區(qū)或國家與國家之間產(chǎn)生禽類貿(mào)易的負(fù)面影響。 再次，疫苗使用的可能潛在危險。正如Hinshow等實驗報道的那樣，疫苗的使用有可能使高致病力變異毒株出現(xiàn)。在禽類中以雞和火雞對禽流感病毒最為易感，其次為珠雞、野雞和孔雀；目前已經(jīng)充分確定全世界在野鳥，尤其是在水禽中存在流感病毒。感染病毒禽及其尸體是主要傳染源，常常通過消化道、呼吸道、皮膚損傷和眼結(jié)膜傳染；吸血昆蟲也可傳播病毒。病雞的卵可帶毒，常使出殼后的雛雞大批死亡，其它年齡雞感染后發(fā)病率和死亡率均很高。－3—3－由此可見，禽流感既可水平傳播，也可經(jīng)卵垂直傳播。AIV感染禽體后，可引起呼吸、消化、生殖和神經(jīng)等多種系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、機(jī)能破壞，母雞產(chǎn)蛋量明顯下降、肉雞生長發(fā)育遲緩，該病潛伏期一般3—5天，常突然爆發(fā)，流行初期的急性病例，可不出現(xiàn)任何明顯癥狀，雞只突然死亡，嚴(yán)重時死亡率可高達(dá)100%。綜合目前國內(nèi)外對該病的研究，主要集中在流行病學(xué)調(diào)查、病原的分離鑒定、特異性診斷、病原的分子生物學(xué)以及疫苗的研制等，特別是在病原的分子生物學(xué)和疫苗的研制方面做了大量的工作，并取得了一定的成績。但對AIV的致病機(jī)理和免疫發(fā)病機(jī)理，迄今未見研究報道，例如，對AI的臨床癥狀和病理學(xué)變化只是處于一種簡單的描述，尚缺乏深入系統(tǒng)的研究，對其免疫病理學(xué)的研究認(rèn)為，局部IgA可起作用，在感染病毒的恢復(fù)中，體液與細(xì)胞免疫均起作用，但體液和細(xì)胞免疫在AIV感染中到底發(fā)揮什么作用、怎么發(fā)揮作用均不清楚。另外，研究最活躍的是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL），認(rèn)為CTL在活病毒感染中發(fā)揮作用，對滅活的流感病毒CTL無作用，究其機(jī)理，目前仍不明了。根據(jù)AI的發(fā)病特點（起病急、流行快、死亡率高等）及造成的嚴(yán)重?fù)p失，對AIV的致病機(jī)理和免疫發(fā)病機(jī)理進(jìn)行全面、深入細(xì)致的研究是十分必要的。因此，本項研究以SPF雞為實驗動物，應(yīng)用病理學(xué)和免疫學(xué)新理論及新技術(shù)，全面、系統(tǒng)、深入地研究A型禽流感的致病機(jī)理，免疫發(fā)病機(jī)理以及細(xì)胞因子的相互作用、調(diào)節(jié)和變化，為禽流感的有效防制提供重要的科學(xué)依據(jù)。－3—4－主要參考文獻(xiàn)：1. 郭元吉等 甲型流感病毒在我國動物中分布的初步調(diào)查 微生物學(xué)報，1981，21（3）：379—3842. 畢英佐等 廣東禽流感的血清學(xué)調(diào)查 中國獸醫(yī)雜志，1994，20（7）：8—93. 陳伯倫等 禽流感研究I 雞A型禽流感病毒的分離和血清學(xué)初步鑒定 中國獸醫(yī)雜志，1994，20（10）：3—54. 陳伯倫等 禽流感研究II 禽流感的發(fā)生和血清學(xué)調(diào)查 中國獸醫(yī)雜志，1994，20（10）：6—75. 程安春等 雞A型流感病毒的分離及初步鑒定 四川畜牧獸醫(yī)，1995，4：5—66. 甘孟侯 禽流感 北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1995，1—127. 孫穎杰 禽流感研究進(jìn)展 畜禽傳染病，1998，18（1）：19—228. 于康震等 97香港禽流感 中國畜禽傳染病，1998，20（3）：187—1919. 唐秀英等 中國禽流感流行株的鑒定 中國畜禽傳染病，1998，20（1）：1—510. 陳化蘭等 DNA免疫誘導(dǎo)雞對禽流感病毒的免疫保護(hù)反應(yīng) 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1998，31（5）：63—6811. 陳伯倫等 關(guān)于禽流感幾個問題的看法 中國畜禽傳染病，1998，20增刊：230—23112. 陳伯倫等 當(dāng)前防制禽流感的建議 中國畜禽傳染病，1998，20增刊：231—23313. 陳化蘭等 禽流感病毒及其分子生物學(xué)研究進(jìn)展 畜禽重大疫病生物技術(shù)防制研究（白新盛、盧景良主編 中國農(nóng)業(yè)科技出版社 1998，5）P：313—32014. 崔尚金等 流感病毒的分子遺傳學(xué) 畜禽重大疫病生物技術(shù)防制研究（白新盛、盧景良主編 中國農(nóng)業(yè)科技出版社 1998，5）P：321—32415. 郭元吉等 中華實驗和臨床病毒雜志，1998，12（4）：322—32516. 陳化蘭等 一株鵝源高致病力禽流感病毒分離株血凝素基因的分析 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999，32（2）：87—9217. 田國斌等 鴨源禽流感病毒的分類和鑒定 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，1999，21（1）：1—318. 鄧國華等 禽流感病毒核蛋白基因在桿狀病毒中的表達(dá) 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，1999，21（2）：81—8319. 賈永清等 禽流感病毒分離株A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)NA基因序列分析 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2000，22（1）：25—3020. 劉明 H5和H7亞型禽流感分子防制技術(shù)的研究 博士論文 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 ，2000，621. 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Bean W J et al Evolution of the H3 influenza virus －3—3－－3—3－－3—3－ 三、研究方案1. 研究目標(biāo)、研究內(nèi)容和擬解決的關(guān)鍵問題（1） 研究目標(biāo) 應(yīng)用組織細(xì)胞培養(yǎng)、免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫酶及電子顯微鏡技術(shù)等現(xiàn)代免疫學(xué)和病理學(xué)新手段，研究不同亞型A型禽流感病毒感染雞的致病機(jī)理和免疫發(fā)病機(jī)理，全面系統(tǒng)地探索AIV導(dǎo)致雞大批死亡的致病機(jī)理以及感染AIV雞全身和局部的細(xì)胞免疫和體液免疫以及細(xì)胞因子的免疫調(diào)節(jié)變化及其相互關(guān)系，從細(xì)胞、亞細(xì)胞、分子水平揭示AIV的致病機(jī)理和AI的免疫發(fā)病機(jī)理，為AI的防制提供重要的科學(xué)依據(jù)，填補(bǔ)該項研究的國內(nèi)外空白。（2） 研究內(nèi)容① 病毒的體內(nèi)分布：研究不同AIV亞型在感染雞體內(nèi)的分布及其含量，揭示AIV的靶組織或靶細(xì)胞。 ② 組織病理學(xué)：研究不同AIV亞型對感染雞全身組織器官（包括心、肝、脾、肺、腎、腦、腸、淋巴組織等）的損傷變化，為闡述AIV致病機(jī)理提供組織病理學(xué)基礎(chǔ)。 ③ 超微病理學(xué)：應(yīng)用電鏡技術(shù)研究AIV感染雞主要組織器官（包括心、肝、脾、肺、腎、腦及免疫器官等）的超微結(jié)構(gòu)變化，從亞細(xì)胞水平揭示AIV的致病機(jī)理。④ 細(xì)胞因子的免疫調(diào)節(jié)：應(yīng)用組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，研究免疫器官組織中白介素—2（IL—2）、腫瘤壞死因子（TNF）、干擾素（IFN）等細(xì)胞因子活性的變化，揭示細(xì)胞因子在AIV感染中的免疫調(diào)節(jié)作用。⑤外周血液免疫學(xué)變化：包括細(xì)胞免疫和體液免疫的檢測，揭示AIV感染時，雞外周血液免疫學(xué)變化的規(guī)律以及與細(xì)胞因子調(diào)節(jié)的相互關(guān)系。⑥免疫器官免疫學(xué)變化：包括免疫器官的細(xì)胞免疫和體液免疫指標(biāo)的檢測，揭示AIV感染時，雞免疫器官的免疫學(xué)變化規(guī)律及其與外周血液免疫學(xué)變化的關(guān)系。⑦粘膜免疫：包括消化道、呼吸道局部粘膜的細(xì)胞和體液免疫指標(biāo)的檢測，揭示AIV感染時，雞粘膜免疫的變化規(guī)律及其與全身免疫的關(guān)系。（3） 擬解決的關(guān)鍵問題 本研究的關(guān)鍵在于全面深入地揭示A型禽流感病毒不同亞型的致病特點以及機(jī)體免疫系統(tǒng)的功能在禽流感發(fā)病中究竟發(fā)揮什么作用。為闡明禽流感的免疫發(fā)病機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。需要解決的關(guān)鍵問題是：①不同亞型的A型禽流感的致病特征及其與致死率的關(guān)系；②全身免疫狀態(tài)與致死的內(nèi)在聯(lián)系；③細(xì)胞因子在禽流感免疫發(fā)病中的免疫調(diào)節(jié)作用。－4－2. 擬采取的研究方法、技術(shù)路線、實驗方案及可行性分析本項研究擬選用中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF實驗動物中心的SPF雛雞為實驗動物。實驗共分7日齡和21日齡兩個大組，每個大組又分為感染禽流感H5（鵝體分離株）亞型病毒組（簡稱I—1組）、感染禽流感H7亞型病毒組（簡稱I—2組）和未感染病毒的對照組（簡稱C組）。其中，I—1和I—2組雛雞分別于7和21日齡時，經(jīng)靜脈接種H5或H7亞型流感病毒尿囊液（1：10稀釋）；C組雛雞未感染病毒為空白對照組。每組雛雞分別飼養(yǎng)于負(fù)壓隔離器內(nèi)，按SPF雛雞要求嚴(yán)格隔離飼養(yǎng)。并分別與感染后1223449和63天，每組隨機(jī)抽取相同數(shù)量雞只迫殺或發(fā)病死亡前剖殺取材，做相應(yīng)處理，檢測以下指標(biāo)：1）病毒的體內(nèi)分布檢測：取心、肝、脾、肺、腎、胸腺、法氏囊等組織器官，采用冰凍切片和酶標(biāo)（或熒光）抗體法檢測病毒在體內(nèi)的分布及其含量。2）組織病理學(xué)檢查：取心、肝、脾、肺、腎、腸及淋巴器官等石蠟包埋，常規(guī)HE染色，檢查各組織器官的病理學(xué)變化。3）超微病理學(xué)檢查：用透射電鏡技術(shù)對主要組織器官（心、肝、脾、肺、腎、腦、胸腺、法氏囊等）的超微結(jié)構(gòu)變化以及病毒在感染細(xì)胞中的分布等進(jìn)行全面檢測。4）細(xì)胞因子的檢測① 胸腺、脾臟的IL—2活性測定——細(xì)胞培養(yǎng)及MTT法② 腫瘤壞死因子（TNF）測定——微量細(xì)胞病變法③ 干擾素（IFN）測定——微量細(xì)胞病變法5）外周血液免疫學(xué)變化檢測：①細(xì)胞免疫指標(biāo)測定T、B細(xì)胞