【文章內容簡介】 中各種帶電粒子與離子交換劑之間結合力的差異進行物質分離的操作技術 ,由于具有簡便、高效、成本低 ,且可自動化連續(xù)操作的優(yōu)點 ,因此一直以來都是溶菌酶生產(chǎn)所常用的方法。常用的離子交換劑有 Duolite 46羧酸纖維素 (PC)、羧甲基纖維素 (CMC)和羧甲基瓊脂糖等。 Li Chang等用Duolite464從性質均一的蛋清溶液中分離溶菌酶 ,建立的一種簡便而有效的工藝過程 ,可使溶菌酶的回收率 高達 9095 %。同時采用 Duolite464分離純化溶菌酶適合于連續(xù)自動化操作。 Durance 等也采用 Duolite464從未被稀釋的蛋清溶液中同時分離溶菌酶和抗生素蛋白 ，但 得率與酶活都不太理想。陜西科技大學的9 朱宏新等人采用弱酸性陽離子交換樹脂 (724 樹脂 )動態(tài)交換洗脫純化工藝對雞蛋殼中的溶菌酶進行分離 ， 724 樹脂的吸附率達到 %。 一般的離子交換劑都具有剛性小、收縮性大、再生手續(xù)麻煩 ,且易被柱堵塞的弊端 ,而李蓉等采用硅膠基質弱陽離子交換劑 XIDACE－ WCX作為填料制作的色譜分離純化蛋 清中的溶菌酶克服了上述的弊端 ,獲得了良好的分離效果 ,活性回收率為 107% ,蛋白的比活為 15467 U/mg,純化倍數(shù)提高了 倍。這種方法比傳統(tǒng)的軟基質離子交換色譜分離法速度快 ,純化效率高。 Ghosh R采 polyvinylidine fluoride(PVDF)膜從蛋清中純化溶菌酶 ,此膜通過離子交換機制選擇性地結合溶菌酶 ,它對大量各種各樣的有機溶劑、酸等有抑制作用 ,能通過加熱復性而不改變膜的孔度 ,與其他合成膜比不易阻塞、更耐用。 3）超濾 超濾技術與傳統(tǒng)的生化分離技術相比主要的優(yōu)點是產(chǎn)品的高產(chǎn)出量 ,然而盡管超濾技術在反滲析及濃縮等過程中得到廣泛的應用 ,但是它作為在生物工業(yè)領域中潛能很大的一種蛋白質分離技術仍然未被得到充分利用。運用超濾技術可以很好地通過調節(jié)而獲得高產(chǎn)量和高純度的產(chǎn)品 ,如果在無菌條件下操作 ,可以直接生產(chǎn)無菌的溶菌酶溶液 , 直接用于臨床治療。 Ghosh R 等 1999 年報道使用經(jīng)肌血球素預先處理的 50 kDa MWCO聚砜膜的超濾系統(tǒng)分離溶菌酶 。 利用這種經(jīng)預先處理過的膜可使溶菌酶的通過量比未經(jīng)處理的膜提高大約 26% ,而其他的蛋清蛋白質的通過量依賴于透膜壓 ( transmembrane pressure,TMP)。隨著透膜壓的升高 ,通過量下降 ,因此通過表面預處理和透膜壓調節(jié)兩種方法綜合使用 ,可使溶菌酶全部通過而其他蛋清蛋白質幾乎全部截留。在透膜壓為 20 kPa 時 ,溶菌酶的純度為 18 %,而在 120 kPa時 ,純度超過 96%。 （二）分離純化方法新進展 1）色譜分離技術 色譜分離技術有多種類型 ,其中膜色譜技術是將液相色譜與膜分離結合起來的一種新技術 ,具有快速、高效、高選擇性、易于放大的特點 ,能滿足生物大分子 高效分離與純化的要求 ,它作為一種高效的分離純化技術已受到人們的高度重視 ,廣泛地應用 于大分子物質的純化。 在膜色譜中，又和親和、離子交換等技術結合，衍生出親和膜色譜技術、離子交換膜色譜技術，均有研究者將其應用到溶菌酶的10 分離純化中。 高速逆流色譜 (HSCCC)技術是一種無固體載體的連續(xù)液 液分配色譜技術 ,其固定相通過重力場和離心力作用被包 。保留在分離柱內 ,避免了固體載體與樣品發(fā)生化學反映而不可逆吸附 ,樣品回收率高 ,郅文波等人利用多分離柱高速逆流色譜 ,研究聚乙二醇 1000(PEG1000)磷酸鹽雙水相體系的固定相保留率及該體系對蛋白質混合物進行分離 ,以 14%PEG100016%的磷酸鹽體系的 上相為固定相 ,在流速 0. 6mol/min和轉速 900r/min 的條件下 ,根據(jù)細胞色素 C、溶菌酶、和血紅蛋白三者的分配系數(shù)的不同對其進行分離 ,三者的收率均大于 90%。 20世紀 80年代末出現(xiàn)了親和色譜技術 ,以親和力為基礎的生物分離技術是將可逆結合的配基 (ligand) 與不溶性的載體 (matrix) 偶聯(lián) ,形成具有特異親和性的分離介質 ,并用其來選擇性的吸附生物活性物質 ,再通過洗脫來分離所需要的物質。西安交通大學李劍君運用間歇式吸附與連續(xù)式脫附耦合親和層析法分離純化了溶菌酶 ,比較了間歇式吸附和連續(xù)式吸附在操 作時間上的差異 ,蛋白質回收率和吸附劑利用率都有所提高。 Anca, M. Yakup將染料配基 (Blue 4 和 Red120) 偶聯(lián)到凝膠上 ,制備出新型的親和層析介質 ,分離純化溶菌酶。通過對這種新型親和染料 配基復合膜對溶菌酶的吸附及動力學特征進行研究 ,結果表明這種染料 配基復合膜與普通膜對溶菌酶的吸附能力分別是 ,提高了 。 此外，還有固定金屬親和層析方法、親和沉淀法、親和過濾法等以親和力為基礎的分離技術，可應用到溶菌酶的分離純化中。 2）反膠團萃取 反膠團萃取是近年發(fā)展起來的一種新的萃取方法 ,它是利用有機溶劑中加入少量表面活性劑形成的反膠團來提取的方法 ,為一些不能使用有機溶劑萃取的酶和活性蛋白質等生物活性物質開拓了一種新的分離技術 ,擴大了有機溶劑萃取的適用范圍。 Sun Y等采用一種親和染料基質反膠團系統(tǒng)從雞蛋清粗溶液中純化溶菌酶 ,這種反膠團是由辛巴藍 F3G－ A與改良的大豆卵磷脂在正己烷中反應制得。用粗蛋清溶液進行分離純化 ,可使溶菌酶的純度提高 16～ 20 倍 ,達到 ～ mg/ mg 蛋白 ,這種親和反膠團系統(tǒng)可以重復使用三次 , 加入聚氧乙 烯 (120) 去水三梨糖醇三油酸酯 ( Tween85)作為輔助表面活性劑可以提高反膠團系統(tǒng)的容量。在 pH 11 ,使用含有 Tween85(20g/L) 的反膠團可以使溶菌酶的產(chǎn)率超過70%。 3） 膨脹床吸附 法 膨脹床吸附技術能直接從未經(jīng)固液分離的生物產(chǎn)品料液中捕集目標產(chǎn)品 ,集固液分離、吸附純化為一體 ,是一個過程集成的操作 ,可以直接從含有細胞或細胞碎片等固體顆粒的高粘度料液中分離純化目標產(chǎn)物。膨脹床吸附 不僅克服了固定床吸附的缺點 ,而且縮短處理時間 ,簡化步驟 ,提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量和質量。 Tong XD 等報道使用被辛巴藍 3GA修飾的一種定制的 Nd－ Fe－ B密實合金瓊脂糖凝膠 ,擴張床吸附系統(tǒng)吸附、純化溶菌酶的結果與使用 CB 修飾的直線型凝膠 (CB－StreamLine) 相比較 ,具有更高的純化倍數(shù)。 Owen 等報道使用連續(xù)逆流、擴張床吸附系統(tǒng)分離溶菌酶 ,該技術克服了一般填充床柱層析的一些存在問題 ,諸如填充材料的壓實、溝槽的形成和由于上樣溶液微粒引起的柱阻塞等。 溶菌酶研究和應用展望 在環(huán)境污染日趨嚴重的當今世界，在倡導綠色食品的今天，溶菌酶作為一種天然蛋白質，能在胃腸內作為營養(yǎng)物質被消化和吸收，對人 體無毒性，也不會在體內殘留，是一種安全性很高的食品保鮮劑、營養(yǎng)保鍵品和藥品。另外，由于人溶菌酶在參與機體的防御機制，在抗感染、抗腫瘤和免疫調節(jié)等方面的作用具有其他來源的溶菌酶無法比擬的優(yōu)勢，具有可觀潛在的臨床應用價值，因此有關人溶菌酶的應用研究以及如何實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)已引起廣泛的重視。采用當前的基因工程技術，利用原核或真核生物作為寄主細胞，從而為實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)人溶菌酶提供了可行的途徑。這必將把溶菌酶的研究利用推入一個嶄新的階段。 參考文獻 [1] 劉源崗 ,鄧倩瑩 ,廖問陶 等 . 溶菌酶的活性測定 .食品科 技 ,2020,10:7173. [2] 于濱 ,遲玉杰 . 高活力蛋清溶菌酶制備技術的研究 .農產(chǎn)品加工 學刊 ,2020,4:46. [3] 洪瀟 ,余若黔 . 溶菌酶的活性測定方法 . 生物技術通報 ,2020,5:4042. 12 第 二部分 實驗部分 實驗一 層析柱裝填及柱效測定 一、 實驗目的和內容 目的： 1. 掌握凝膠過濾層析的原理，掌握凝膠柱柱效測定方法； 2. 熟悉凝膠層析的一般過程； 3. 了解凝膠介質的選擇原則和應用領域。 內容： 1. Sephadex G50 凝膠柱的裝填； 2. 凝膠柱柱效測定。 3． 凝膠再生的方法； 二、 實驗儀器和試劑 1. 實驗儀器 層析柱（ 1 40 cm），砝碼天平，玻璃棒， 分部收集器，核酸蛋白質檢測儀，記錄儀，滴頭吸管， 2. 實驗材料和試劑 Sephadex G50， ， 5％丙酮（ PBS 緩沖液作為溶劑） 三、 實驗步驟 清洗層析柱 測定層析柱的內徑、高度，計算所需凝膠的體積 根據(jù) Sephadex G50的膨脹體積，計算所需干凝膠的質量 稱取相應質量 的干凝膠，加入其總吸液量 10倍的 mol/L PBS 在 100℃水浴中加熱溶脹 1 小時以上，溶脹之后將極細的小顆粒傾瀉出去 13 用真空干燥器抽盡凝膠中空氣，并將凝膠上面過多的溶液傾出 關閉層析柱出水口，向柱管內加入約 1/4 柱容積的洗脫液 （重復使用的填料，從此步開始） 邊攪拌，邊將薄漿狀的凝膠液連續(xù)傾入柱中，使其自然沉降 等凝膠沉降約 23cm 后，打開柱的出口，調節(jié)合適的流速，使凝膠繼續(xù)沉積 待沉積的膠面上升到離柱的頂端約 5cm 處時停止裝柱，關閉出水口 通過 23 倍柱床體積的洗脫液 使柱床穩(wěn)定 (流速 ～ 1 mL/min) 始終保護凝膠上端有一段液體 準備好恒流泵、分部收集器、核酸蛋白檢測儀及記錄儀 打開柱上端的螺絲帽塞子，吸出層析柱中多余液體直至與膠面相切 沿管壁將 5%丙酮溶液 mL 小心加到凝膠床面上，應避免 將床面凝膠沖起 （參考完成時間 11： 30） 打開下口夾子，使樣品溶液流入柱內，同時收集流出液，當樣品溶液流至與膠面相切時，夾緊下口夾子 按加樣操作，用 1 mL 洗脫液沖洗管壁 2次 加入 3－ 4 mL 洗脫液于凝膠上，旋緊上口螺絲帽 14 將層析柱進 水口連通恒流泵，柱出水口與核酸蛋白質檢測儀比色池進液口相連，比色池出液口再與自動部分收集器相連，用兩根導線將檢測儀與記錄儀連接起來，設置好基線的位置 洗脫時，打開上、下進出口夾子，用 ，以 ～ 1 mL/min 流速洗脫，記錄 tr(記錄儀紙速設為 12cm/h，電壓 200mv；核酸蛋白監(jiān)測儀檢測波長 254nm，靈敏度為 )， 計算 單位高度的 柱效 （參考完成時間 16：00） 柱效計算公式： N = ?［ θ r/( W 1/2)］ 2 其中， θ r為平均洗脫 時間， W 1/2為半峰寬。 均為無因次特性值， 測量時精確到 1mm。 [Sephadex G100每米理論塔板數(shù)為 3000～ 6000] 四、 注意事項 1）各接頭不能漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液。 2）裝柱要均勻，既不過松，也不過緊，最好在要求的操作壓下裝柱，流速不宜過快，避免因此壓緊凝膠。 3）始終保持柱內液面高于凝膠表面，否則水分蒸發(fā)，凝膠變干。也要防止液體流干，使凝膠混入大量氣泡，影響液體在柱內的流動。 4）所用凝膠比較昂貴，需小心 操作，實驗后回收，盡量避免浪費和損失。 五、 演示 核酸蛋白檢測儀及記錄儀操作方法 在儀器使用前，首先檢查檢測器，電源和記錄儀三部份電路連接是否正確，插上電源插頭。 接通記錄儀電源開關，使電源開關拔到“通”指示燈亮?？筛鶕?jù)需要調換不同的走紙速度。記錄儀量程調在 10mV 檔上。 將檢測儀波長旋鈕旋到所需波長刻度上，把量程旋鈕拔到 100％ T 檔。 15 按下檢測儀電源箱面板上的電源開關，此時記錄儀指針從零點開始向右移動某一刻度，調節(jié)“光量”旋鈕使指針停留在記錄儀大約中間位置 5mV 左右數(shù)字顯示為 50左右。儀器開 機穩(wěn)定時間大約在 1 小時左右，待基線平直后，可加樣測試。 把檢測器進樣口塑料 膠 管接到部份收集器上，使層析柱中的洗脫液通過。透光率為“ 0”廠家巳調好，光密度 A 要調零，量程開關拔到 100％ T，調節(jié)光量旋鈕，使記錄儀指針在 10mV 數(shù)字顯示為 100，即透光率為 100%。把量程開關拔到“ A”擋，緩慢調節(jié) A 調零旋鈕，使檢測儀數(shù)字顯示為“ 0” ， 同時調節(jié)記錄儀零位旋紐使記錄儀指示在 0位 。 上述 5 個步驟結束后，就可以在層析柱上加樣。當樣品經(jīng)層析柱分離，通過檢測后，就能通過記錄儀給出所需樣品吸收的圖譜。 測 試完畢，必須切斷電源，并用蒸餾水清洗樣品池和尼龍管。 記錄儀光吸收 A讀數(shù) 當采用 l0mV 量程記錄儀時，記錄儀的滿量程讀數(shù)對應于 A 量程開關所對應的 A 讀數(shù)范圍。如 A量程開關選定在 時，則記錄儀滿量程光吸收 A 讀數(shù)為 ，當記錄筆指示在記錄紙一半 (50%刻度 )位置時即為 。 數(shù)字顯示光吸收 A 讀數(shù)