【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 中各種帶電粒子與離子交換劑之間結(jié)合力的差異進(jìn)行物質(zhì)分離的操作技術(shù) ,由于具有簡(jiǎn)便、高效、成本低 ,且可自動(dòng)化連續(xù)操作的優(yōu)點(diǎn) ,因此一直以來(lái)都是溶菌酶生產(chǎn)所常用的方法。常用的離子交換劑有 Duolite 46羧酸纖維素 (PC)、羧甲基纖維素 (CMC)和羧甲基瓊脂糖等。 Li Chang等用Duolite464從性質(zhì)均一的蛋清溶液中分離溶菌酶 ,建立的一種簡(jiǎn)便而有效的工藝過(guò)程 ,可使溶菌酶的回收率 高達(dá) 9095 %。同時(shí)采用 Duolite464分離純化溶菌酶適合于連續(xù)自動(dòng)化操作。 Durance 等也采用 Duolite464從未被稀釋的蛋清溶液中同時(shí)分離溶菌酶和抗生素蛋白 ，但 得率與酶活都不太理想。陜西科技大學(xué)的9 朱宏新等人采用弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 (724 樹(shù)脂 )動(dòng)態(tài)交換洗脫純化工藝對(duì)雞蛋殼中的溶菌酶進(jìn)行分離 ， 724 樹(shù)脂的吸附率達(dá)到 %。 一般的離子交換劑都具有剛性小、收縮性大、再生手續(xù)麻煩 ,且易被柱堵塞的弊端 ,而李蓉等采用硅膠基質(zhì)弱陽(yáng)離子交換劑 XIDACE－ WCX作為填料制作的色譜分離純化蛋 清中的溶菌酶克服了上述的弊端 ,獲得了良好的分離效果 ,活性回收率為 107% ,蛋白的比活為 15467 U/mg,純化倍數(shù)提高了 倍。這種方法比傳統(tǒng)的軟基質(zhì)離子交換色譜分離法速度快 ,純化效率高。 Ghosh R采 polyvinylidine fluoride(PVDF)膜從蛋清中純化溶菌酶 ,此膜通過(guò)離子交換機(jī)制選擇性地結(jié)合溶菌酶 ,它對(duì)大量各種各樣的有機(jī)溶劑、酸等有抑制作用 ,能通過(guò)加熱復(fù)性而不改變膜的孔度 ,與其他合成膜比不易阻塞、更耐用。 3）超濾 超濾技術(shù)與傳統(tǒng)的生化分離技術(shù)相比主要的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)品的高產(chǎn)出量 ,然而盡管超濾技術(shù)在反滲析及濃縮等過(guò)程中得到廣泛的應(yīng)用 ,但是它作為在生物工業(yè)領(lǐng)域中潛能很大的一種蛋白質(zhì)分離技術(shù)仍然未被得到充分利用。運(yùn)用超濾技術(shù)可以很好地通過(guò)調(diào)節(jié)而獲得高產(chǎn)量和高純度的產(chǎn)品 ,如果在無(wú)菌條件下操作 ,可以直接生產(chǎn)無(wú)菌的溶菌酶溶液 , 直接用于臨床治療。 Ghosh R 等 1999 年報(bào)道使用經(jīng)肌血球素預(yù)先處理的 50 kDa MWCO聚砜膜的超濾系統(tǒng)分離溶菌酶 。 利用這種經(jīng)預(yù)先處理過(guò)的膜可使溶菌酶的通過(guò)量比未經(jīng)處理的膜提高大約 26% ,而其他的蛋清蛋白質(zhì)的通過(guò)量依賴(lài)于透膜壓 ( transmembrane pressure,TMP)。隨著透膜壓的升高 ,通過(guò)量下降 ,因此通過(guò)表面預(yù)處理和透膜壓調(diào)節(jié)兩種方法綜合使用 ,可使溶菌酶全部通過(guò)而其他蛋清蛋白質(zhì)幾乎全部截留。在透膜壓為 20 kPa 時(shí) ,溶菌酶的純度為 18 %,而在 120 kPa時(shí) ,純度超過(guò) 96%。 （二）分離純化方法新進(jìn)展 1）色譜分離技術(shù) 色譜分離技術(shù)有多種類(lèi)型 ,其中膜色譜技術(shù)是將液相色譜與膜分離結(jié)合起來(lái)的一種新技術(shù) ,具有快速、高效、高選擇性、易于放大的特點(diǎn) ,能滿(mǎn)足生物大分子 高效分離與純化的要求 ,它作為一種高效的分離純化技術(shù)已受到人們的高度重視 ,廣泛地應(yīng)用 于大分子物質(zhì)的純化。 在膜色譜中，又和親和、離子交換等技術(shù)結(jié)合，衍生出親和膜色譜技術(shù)、離子交換膜色譜技術(shù)，均有研究者將其應(yīng)用到溶菌酶的10 分離純化中。 高速逆流色譜 (HSCCC)技術(shù)是一種無(wú)固體載體的連續(xù)液 液分配色譜技術(shù) ,其固定相通過(guò)重力場(chǎng)和離心力作用被包 。保留在分離柱內(nèi) ,避免了固體載體與樣品發(fā)生化學(xué)反映而不可逆吸附 ,樣品回收率高 ,郅文波等人利用多分離柱高速逆流色譜 ,研究聚乙二醇 1000(PEG1000)磷酸鹽雙水相體系的固定相保留率及該體系對(duì)蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行分離 ,以 14%PEG100016%的磷酸鹽體系的 上相為固定相 ,在流速 0. 6mol/min和轉(zhuǎn)速 900r/min 的條件下 ,根據(jù)細(xì)胞色素 C、溶菌酶、和血紅蛋白三者的分配系數(shù)的不同對(duì)其進(jìn)行分離 ,三者的收率均大于 90%。 20世紀(jì) 80年代末出現(xiàn)了親和色譜技術(shù) ,以親和力為基礎(chǔ)的生物分離技術(shù)是將可逆結(jié)合的配基 (ligand) 與不溶性的載體 (matrix) 偶聯(lián) ,形成具有特異親和性的分離介質(zhì) ,并用其來(lái)選擇性的吸附生物活性物質(zhì) ,再通過(guò)洗脫來(lái)分離所需要的物質(zhì)。西安交通大學(xué)李劍君運(yùn)用間歇式吸附與連續(xù)式脫附耦合親和層析法分離純化了溶菌酶 ,比較了間歇式吸附和連續(xù)式吸附在操 作時(shí)間上的差異 ,蛋白質(zhì)回收率和吸附劑利用率都有所提高。 Anca, M. Yakup將染料配基 (Blue 4 和 Red120) 偶聯(lián)到凝膠上 ,制備出新型的親和層析介質(zhì) ,分離純化溶菌酶。通過(guò)對(duì)這種新型親和染料 配基復(fù)合膜對(duì)溶菌酶的吸附及動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行研究 ,結(jié)果表明這種染料 配基復(fù)合膜與普通膜對(duì)溶菌酶的吸附能力分別是 ,提高了 。 此外，還有固定金屬親和層析方法、親和沉淀法、親和過(guò)濾法等以親和力為基礎(chǔ)的分離技術(shù)，可應(yīng)用到溶菌酶的分離純化中。 2）反膠團(tuán)萃取 反膠團(tuán)萃取是近年發(fā)展起來(lái)的一種新的萃取方法 ,它是利用有機(jī)溶劑中加入少量表面活性劑形成的反膠團(tuán)來(lái)提取的方法 ,為一些不能使用有機(jī)溶劑萃取的酶和活性蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)開(kāi)拓了一種新的分離技術(shù) ,擴(kuò)大了有機(jī)溶劑萃取的適用范圍。 Sun Y等采用一種親和染料基質(zhì)反膠團(tuán)系統(tǒng)從雞蛋清粗溶液中純化溶菌酶 ,這種反膠團(tuán)是由辛巴藍(lán) F3G－ A與改良的大豆卵磷脂在正己烷中反應(yīng)制得。用粗蛋清溶液進(jìn)行分離純化 ,可使溶菌酶的純度提高 16～ 20 倍 ,達(dá)到 ～ mg/ mg 蛋白 ,這種親和反膠團(tuán)系統(tǒng)可以重復(fù)使用三次 , 加入聚氧乙 烯 (120) 去水三梨糖醇三油酸酯 ( Tween85)作為輔助表面活性劑可以提高反膠團(tuán)系統(tǒng)的容量。在 pH 11 ,使用含有 Tween85(20g/L) 的反膠團(tuán)可以使溶菌酶的產(chǎn)率超過(guò)70%。 3） 膨脹床吸附 法 膨脹床吸附技術(shù)能直接從未經(jīng)固液分離的生物產(chǎn)品料液中捕集目標(biāo)產(chǎn)品 ,集固液分離、吸附純化為一體 ,是一個(gè)過(guò)程集成的操作 ,可以直接從含有細(xì)胞或細(xì)胞碎片等固體顆粒的高粘度料液中分離純化目標(biāo)產(chǎn)物。膨脹床吸附 不僅克服了固定床吸附的缺點(diǎn) ,而且縮短處理時(shí)間 ,簡(jiǎn)化步驟 ,提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。 Tong XD 等報(bào)道使用被辛巴藍(lán) 3GA修飾的一種定制的 Nd－ Fe－ B密實(shí)合金瓊脂糖凝膠 ,擴(kuò)張床吸附系統(tǒng)吸附、純化溶菌酶的結(jié)果與使用 CB 修飾的直線(xiàn)型凝膠 (CB－StreamLine) 相比較 ,具有更高的純化倍數(shù)。 Owen 等報(bào)道使用連續(xù)逆流、擴(kuò)張床吸附系統(tǒng)分離溶菌酶 ,該技術(shù)克服了一般填充床柱層析的一些存在問(wèn)題 ,諸如填充材料的壓實(shí)、溝槽的形成和由于上樣溶液微粒引起的柱阻塞等。 溶菌酶研究和應(yīng)用展望 在環(huán)境污染日趨嚴(yán)重的當(dāng)今世界，在倡導(dǎo)綠色食品的今天，溶菌酶作為一種天然蛋白質(zhì)，能在胃腸內(nèi)作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消化和吸收，對(duì)人 體無(wú)毒性，也不會(huì)在體內(nèi)殘留，是一種安全性很高的食品保鮮劑、營(yíng)養(yǎng)保鍵品和藥品。另外，由于人溶菌酶在參與機(jī)體的防御機(jī)制，在抗感染、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等方面的作用具有其他來(lái)源的溶菌酶無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，具有可觀(guān)潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，因此有關(guān)人溶菌酶的應(yīng)用研究以及如何實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)已引起廣泛的重視。采用當(dāng)前的基因工程技術(shù)，利用原核或真核生物作為寄主細(xì)胞，從而為實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)人溶菌酶提供了可行的途徑。這必將把溶菌酶的研究利用推入一個(gè)嶄新的階段。 參考文獻(xiàn) [1] 劉源崗 ,鄧倩瑩 ,廖問(wèn)陶 等 . 溶菌酶的活性測(cè)定 .食品科 技 ,2020,10:7173. [2] 于濱 ,遲玉杰 . 高活力蛋清溶菌酶制備技術(shù)的研究 .農(nóng)產(chǎn)品加工 學(xué)刊 ,2020,4:46. [3] 洪瀟 ,余若黔 . 溶菌酶的活性測(cè)定方法 . 生物技術(shù)通報(bào) ,2020,5:4042. 12 第 二部分 實(shí)驗(yàn)部分 實(shí)驗(yàn)一 層析柱裝填及柱效測(cè)定 一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容 目的： 1. 掌握凝膠過(guò)濾層析的原理，掌握凝膠柱柱效測(cè)定方法； 2. 熟悉凝膠層析的一般過(guò)程； 3. 了解凝膠介質(zhì)的選擇原則和應(yīng)用領(lǐng)域。 內(nèi)容： 1. Sephadex G50 凝膠柱的裝填； 2. 凝膠柱柱效測(cè)定。 3． 凝膠再生的方法； 二、 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 1. 實(shí)驗(yàn)儀器 層析柱（ 1 40 cm），砝碼天平，玻璃棒， 分部收集器，核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀，記錄儀，滴頭吸管， 2. 實(shí)驗(yàn)材料和試劑 Sephadex G50， ， 5％丙酮（ PBS 緩沖液作為溶劑） 三、 實(shí)驗(yàn)步驟 清洗層析柱 測(cè)定層析柱的內(nèi)徑、高度，計(jì)算所需凝膠的體積 根據(jù) Sephadex G50的膨脹體積，計(jì)算所需干凝膠的質(zhì)量 稱(chēng)取相應(yīng)質(zhì)量 的干凝膠，加入其總吸液量 10倍的 mol/L PBS 在 100℃水浴中加熱溶脹 1 小時(shí)以上，溶脹之后將極細(xì)的小顆粒傾瀉出去 13 用真空干燥器抽盡凝膠中空氣，并將凝膠上面過(guò)多的溶液傾出 關(guān)閉層析柱出水口，向柱管內(nèi)加入約 1/4 柱容積的洗脫液 （重復(fù)使用的填料，從此步開(kāi)始） 邊攪拌，邊將薄漿狀的凝膠液連續(xù)傾入柱中，使其自然沉降 等凝膠沉降約 23cm 后，打開(kāi)柱的出口，調(diào)節(jié)合適的流速，使凝膠繼續(xù)沉積 待沉積的膠面上升到離柱的頂端約 5cm 處時(shí)停止裝柱，關(guān)閉出水口 通過(guò) 23 倍柱床體積的洗脫液 使柱床穩(wěn)定 (流速 ～ 1 mL/min) 始終保護(hù)凝膠上端有一段液體 準(zhǔn)備好恒流泵、分部收集器、核酸蛋白檢測(cè)儀及記錄儀 打開(kāi)柱上端的螺絲帽塞子，吸出層析柱中多余液體直至與膠面相切 沿管壁將 5%丙酮溶液 mL 小心加到凝膠床面上，應(yīng)避免 將床面凝膠沖起 （參考完成時(shí)間 11： 30） 打開(kāi)下口夾子，使樣品溶液流入柱內(nèi)，同時(shí)收集流出液，當(dāng)樣品溶液流至與膠面相切時(shí)，夾緊下口夾子 按加樣操作，用 1 mL 洗脫液沖洗管壁 2次 加入 3－ 4 mL 洗脫液于凝膠上，旋緊上口螺絲帽 14 將層析柱進(jìn) 水口連通恒流泵，柱出水口與核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀比色池進(jìn)液口相連，比色池出液口再與自動(dòng)部分收集器相連，用兩根導(dǎo)線(xiàn)將檢測(cè)儀與記錄儀連接起來(lái)，設(shè)置好基線(xiàn)的位置 洗脫時(shí)，打開(kāi)上、下進(jìn)出口夾子，用 ，以 ～ 1 mL/min 流速洗脫，記錄 tr(記錄儀紙速設(shè)為 12cm/h，電壓 200mv；核酸蛋白監(jiān)測(cè)儀檢測(cè)波長(zhǎng) 254nm，靈敏度為 )， 計(jì)算 單位高度的 柱效 （參考完成時(shí)間 16：00） 柱效計(jì)算公式： N = ?［ θ r/( W 1/2)］ 2 其中， θ r為平均洗脫 時(shí)間， W 1/2為半峰寬。 均為無(wú)因次特性值， 測(cè)量時(shí)精確到 1mm。 [Sephadex G100每米理論塔板數(shù)為 3000～ 6000] 四、 注意事項(xiàng) 1）各接頭不能漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液。 2）裝柱要均勻，既不過(guò)松，也不過(guò)緊，最好在要求的操作壓下裝柱，流速不宜過(guò)快，避免因此壓緊凝膠。 3）始終保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，否則水分蒸發(fā)，凝膠變干。也要防止液體流干，使凝膠混入大量氣泡，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)。 4）所用凝膠比較昂貴，需小心 操作，實(shí)驗(yàn)后回收，盡量避免浪費(fèi)和損失。 五、 演示 核酸蛋白檢測(cè)儀及記錄儀操作方法 在儀器使用前，首先檢查檢測(cè)器，電源和記錄儀三部份電路連接是否正確，插上電源插頭。 接通記錄儀電源開(kāi)關(guān)，使電源開(kāi)關(guān)拔到“通”指示燈亮?？筛鶕?jù)需要調(diào)換不同的走紙速度。記錄儀量程調(diào)在 10mV 檔上。 將檢測(cè)儀波長(zhǎng)旋鈕旋到所需波長(zhǎng)刻度上，把量程旋鈕拔到 100％ T 檔。 15 按下檢測(cè)儀電源箱面板上的電源開(kāi)關(guān)，此時(shí)記錄儀指針從零點(diǎn)開(kāi)始向右移動(dòng)某一刻度，調(diào)節(jié)“光量”旋鈕使指針停留在記錄儀大約中間位置 5mV 左右數(shù)字顯示為 50左右。儀器開(kāi) 機(jī)穩(wěn)定時(shí)間大約在 1 小時(shí)左右，待基線(xiàn)平直后，可加樣測(cè)試。 把檢測(cè)器進(jìn)樣口塑料 膠 管接到部份收集器上，使層析柱中的洗脫液通過(guò)。透光率為“ 0”廠(chǎng)家巳調(diào)好，光密度 A 要調(diào)零，量程開(kāi)關(guān)拔到 100％ T，調(diào)節(jié)光量旋鈕，使記錄儀指針在 10mV 數(shù)字顯示為 100，即透光率為 100%。把量程開(kāi)關(guān)拔到“ A”擋，緩慢調(diào)節(jié) A 調(diào)零旋鈕，使檢測(cè)儀數(shù)字顯示為“ 0” ， 同時(shí)調(diào)節(jié)記錄儀零位旋紐使記錄儀指示在 0位 。 上述 5 個(gè)步驟結(jié)束后，就可以在層析柱上加樣。當(dāng)樣品經(jīng)層析柱分離，通過(guò)檢測(cè)后，就能通過(guò)記錄儀給出所需樣品吸收的圖譜。 測(cè) 試完畢，必須切斷電源，并用蒸餾水清洗樣品池和尼龍管。 記錄儀光吸收 A讀數(shù) 當(dāng)采用 l0mV 量程記錄儀時(shí)，記錄儀的滿(mǎn)量程讀數(shù)對(duì)應(yīng)于 A 量程開(kāi)關(guān)所對(duì)應(yīng)的 A 讀數(shù)范圍。如 A量程開(kāi)關(guān)選定在 時(shí)，則記錄儀滿(mǎn)量程光吸收 A 讀數(shù)為 ，當(dāng)記錄筆指示在記錄紙一半 (50%刻度 )位置時(shí)即為 。 數(shù)字顯示光吸收 A 讀數(shù)