【文章內(nèi)容簡介】 子梗和分生孢子產(chǎn)生在分生孢子盤或分生孢子器內(nèi)。1）大莖點(diǎn)屬 (Macrophoma) 觀察大葉黃楊病葉材料，作徒手切片，鏡檢。觀察分生孢子器、分生孢子梗、分生孢子并與莖點(diǎn)霉屬比較,注意比較分生孢子的大小。2）色二孢屬 (Diplodia) 觀察松枯枝病。分生孢子器球形。 分生孢子處為單細(xì)胞，無色，成熟后為雙細(xì)胞，褐色，橢圓形或卵形。（三）冬孢菌綱(Teliomycetes)　　本綱真菌的特征是不形成擔(dān)子果，擔(dān)子從冬孢子上產(chǎn)生，冬孢子成堆或分散。這是一類較低等的擔(dān)子菌，包含兩個目：銹菌目和黑粉菌目,其中絕大多數(shù)種類均寄生于植物上，是一類重要的植物病原菌。1）膠銹菌屬 (Gymnosporangium)　　沒有夏孢子階段；冬孢子雙細(xì)胞，有可以膠化的長柄， 觀察梨膠銹菌()所形成的銹病癥狀。鏡檢銹孢子器和性孢子器切片。挑取檜柏上吸水膨大的冬孢子堆(角)鏡檢。2）柱銹菌屬（Cronartium）冬孢子排列成柱狀。三、作業(yè)與思考題1）半知菌亞門根據(jù)什么特征分類？有幾個綱，舉出代表性的病害和病菌。2）半知菌的學(xué)名和中文屬名的名稱中包含著什么內(nèi)容。3）繪膠銹菌屬的形態(tài)圖。4）分清長生活史、短生活史、多型現(xiàn)象、轉(zhuǎn)主寄主、專性寄主、鎖狀聯(lián)合等術(shù)語概念。實(shí)驗(yàn)四 林木病害的其他病原觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．了解植物病原細(xì)菌及線蟲所致病害癥狀特點(diǎn)。2．學(xué)習(xí)鏡檢細(xì)菌、線蟲的基本方法。3．認(rèn)識植物病毒形態(tài)和病毒病主要癥狀類型，二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1．細(xì)菌是單細(xì)胞的原核生物，有細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器，有的細(xì)菌有鞭毛、莢膜和芽孢的結(jié)構(gòu)。細(xì)菌個體微小，往往需制成涂片并經(jīng)染色后，在顯微鏡油浸的物鏡下觀察。植物病原細(xì)菌都是桿狀菌，其分屬依據(jù)是鞭毛數(shù)及著生方式、格蘭氏染色反應(yīng)、在培養(yǎng)基上長成的菌落色澤、形狀和生理生化反應(yīng)。2．一般細(xì)菌病害病斑或病部周圍組織呈水漬狀，在潮濕條件下可在病部溢出菌膿，干后形成菌膠。菌膿在清晨或潮濕天氣較易觀察到。將病部特別是病鍵交接處切片鏡檢時，一般可見到大量細(xì)菌從病部（特別是維管束向外涌出），像煙囪冒出的煙霧，這種菌溢現(xiàn)象是診斷細(xì)菌病害的簡便而可靠的方法。3．植物寄生線蟲是又一類重要病原物。除直接致病外，有的線蟲可以傳帶病毒，或造成植物傷口以利于其它病原微生物侵染。植物線蟲主要在寄主的根際或根內(nèi)、莖、葉和種子內(nèi)生存，有的形成蟲癭（如根結(jié)線蟲）。引起植物病害的癥狀主要是營養(yǎng)不良、生長衰弱或畸形，從而降低產(chǎn)量或品質(zhì)。植物寄生線蟲是病原物中個體較大的，但是多數(shù)仍不能用肉眼看到或看清楚，需用低倍顯微鏡觀察。線蟲蟲體分頭、頸、腹、尾4部分。頭部有唇、口腔、吻針和側(cè)器；頸部包括食道、神經(jīng)環(huán)和排泄孔；腹部有腸管和生殖器官，后端有肛門；尾部有側(cè)尾腺和尾腺。分辨科、屬、種的主要依據(jù)是體形、食道、頭和尾部的主要形態(tài)特征。4．病毒顆粒很小，必須用電子顯微鏡才能觀察到。植物病毒顆粒可以分為圓球狀（或等邊多面體）、炮彈狀、長桿狀和線條狀4種。這些在課堂和本次實(shí)驗(yàn)課上只能通過觀看電鏡照片或幻燈片來了解。5．植物病毒病的主要癥狀類型有花葉、變色、條紋、枯斑或環(huán)斑壞死、畸形。應(yīng)該注意：一方面這些癥狀類型的分辨在病毒病鑒定上具有比起它病害更重要的意義，另一方面在實(shí)際觀察中，也會發(fā)現(xiàn)同一種病毒病在發(fā)病過程中或在不同環(huán)境條件下會有不同的表現(xiàn)（不同病狀甚至隱癥）。6．病毒病多為系統(tǒng)性侵染，沒有病征，易與非侵染性病害相混淆，往往需要通過一定方式的傳染試驗(yàn)證實(shí)其傳染性。三、實(shí)驗(yàn)材料及用具植物病原細(xì)菌、病毒和寄生線蟲所致病害癥狀標(biāo)本、顯微鏡、玻片、酒精燈、培養(yǎng)皿、化學(xué)試劑（堿性品紅、苯酚、亞甲藍(lán)、氫氧化鉀、酒精）。四、實(shí)驗(yàn)步驟1．觀察下列病害標(biāo)本，區(qū)分各類癥狀。桃細(xì)菌性穿孔病、青枯病等。附帶觀察寄生性種子植物大豆菟絲子。注意觀察細(xì)菌性病害的菌膿和菌膠、線蟲的蟲癭。2．取細(xì)菌性病害的標(biāo)本，最好是新鮮的，在病斑邊緣或病健交接處切開，或?qū)⑤^小的葉段移到玻片上的水滴里，加蓋玻片，稍停片刻在顯微鏡下觀察菌溢現(xiàn)象。3．涂片——固定——染色觀察細(xì)菌形態(tài)1）涂片 取一干凈的載玻片，在中央偏左處滴一滴無菌水，然后用接種針在細(xì)菌病害腐爛部分或溢膿上挑取一點(diǎn)膿狀物，移至水滴中混勻，用另一張在玻片的一端與細(xì)菌懸浮液滴接觸，并沿底邊平行方向向右移動，涂布后的片子須在空氣中來回晃動，以加速其干燥。另一種做法是將有細(xì)菌懸浮滴的玻片直立，使菌液流動，形成一條細(xì)菌懸浮液膜，讓其自然干燥。2）固定 用拇指和食指拿住涂好的玻片一端，有菌面朝上，在酒精燈上往返通過3～4次，注意通過火焰時要使玻片各處受熱均勻，不可固定烘烤一處，溫度也不要太高。進(jìn)行鞭毛染色的玻片一般不用火焰加熱法固定，而用1%福爾馬林溶液固定。3）染色 常用于細(xì)菌染色的染色劑和染色法有以下兩種：苯酚品紅染色法：溶液I：堿性品紅 ，酒精（95%） 10mL；溶液II：苯酚（結(jié)晶）5g，蒸餾水 95mL。將溶液I和溶液II分別配好后混合，用滴管移到涂片上染色1分鐘，然后用清水沖洗，直至水中沒有紅色為止。亞甲藍(lán)染色法：溶液I：亞甲藍(lán) ，酒精（95%） 30mL；溶液II：氫氧化鉀溶液（%）100mL。溶液I和II分別配好后混合放置備用。染色時將上述染色劑移到涂片上靜置1分鐘后，用清水沖洗直至水中看不到藍(lán)色為止。用吸水紙吸去水分或風(fēng)干，即可供鏡檢。4）鏡檢 先將物鏡中的油鏡（90）轉(zhuǎn)至鏡筒正下方，在染色的細(xì)菌涂片標(biāo)本上滴一滴香柏油，將油鏡降至香柏油中，再側(cè)視，把物鏡降至十分貼近載玻片的高度，然后用眼睛對準(zhǔn)目鏡，邊觀察邊轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)輪使鏡筒徐徐上升，看到標(biāo)本后轉(zhuǎn)動細(xì)調(diào)節(jié)輪調(diào)整焦距，使物像清晰。如果沒有找到細(xì)菌，則要重新再側(cè)視的情況下將物鏡降至貼近載玻片的位置，重復(fù)上述操作。切不可用粗調(diào)節(jié)輪由上向下降低物鏡，以免損傷鏡頭和玻片。油鏡用畢，須用擦鏡紙沾二甲苯擦凈。4．線蟲形態(tài)的觀察 將線蟲蟲癭浸在水中約1小時，用解剖針挑取種皮內(nèi)的白色物移到載玻片上的水滴中，蓋上蓋玻片鏡檢。用低倍鏡找到適合觀察的線蟲后再換高倍鏡觀察各種器官的形態(tài)。五、作業(yè)與思考1．完成2片以上的細(xì)菌涂片（經(jīng)染色）。2．繪制顯微鏡下觀察到的細(xì)菌菌溢現(xiàn)象示意圖。3．繪制線蟲結(jié)構(gòu)簡圖。實(shí)驗(yàn)五 病原物的分離與培養(yǎng)基本原理：柯赫氏法則（Koch’s Postulate）是通過一系列步驟確定引起病害的病原物的原則和方法，是診斷病害中的證病律。其基本步驟如下：1．在染病組織上用顯微鏡經(jīng)常檢查到某種微生物；2．從病組織中分離得到該微生物，并獲得純培養(yǎng)；3．將純培養(yǎng)的微生物接種到健康的感病寄主植物后，發(fā)生原先觀察到的癥狀；4．從接種發(fā)病的組織中，再分離，又得到相同的微生物。全過程擬分兩次實(shí)驗(yàn)完成，本次完成第一和第二步。包括實(shí)驗(yàn)十三培養(yǎng)基的制作和本次實(shí)驗(yàn)病原物的分離、培養(yǎng)及純化。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆詹≡锓蛛x、培養(yǎng)和純化的一般方法。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（一）真菌的分離1．分離前的準(zhǔn)備工作分離和培養(yǎng)應(yīng)在很清潔，甚至無菌的條件下進(jìn)行。如在無菌室、無菌操作箱、超凈工作臺和清潔的室內(nèi)。無菌操作箱的內(nèi)壁可以用升汞液（1：1000）擦洗，使用超凈工作臺應(yīng)事先開動運(yùn)行15分鐘左右。在屋頂四壁清潔而空氣較靜止的房間進(jìn)行時，要將地面掃凈擦濕，用1：1000的升汞液或清水擦凈工作臺，并在臺上鋪一塊干凈濕白布，將所需物品都放在臺布上，工作時避免走動，以減少污染。2．分離材料的選擇選擇新近發(fā)病的植株、器官或組織作為分離材料，可以減少腐生菌的污染。從病健交界處分離這一原則對于大部分病害的分離都是適用的。而有些有暈圈的斑點(diǎn)病（如野火?。?，病菌局限在斑點(diǎn)中央的壞死組織中，從斑點(diǎn)邊緣是分離不到病菌的。3．組織表面消毒從植株或組織上取下的分離材料，必須進(jìn)行表面消毒，以殺死或減少病組織表面的腐生菌，保留組織內(nèi)部的病原菌。常用的表面消毒液有：1）升汞消毒液配方為：升汞 1g， 濃鹽酸 ， 水 1000mL。將升汞溶于濃鹽酸中，待其充分溶解后，用水稀釋。升汞劇毒、無色，為便于認(rèn)識，可在溶液中加幾滴紅染料。消毒時間因材料質(zhì)地、發(fā)病部位深淺及污染情況而異，一般3～5分鐘。消毒后用無菌水沖洗3～4次。2）漂白粉消毒液有些真菌對汞、銅等金屬離子敏感，可用漂白粉消毒液。其配方為：漂白粉 10g， 水 140mL。選用新鮮漂白粉，將漂白粉溶于水中，過濾后使用，隨用隨配，不能久留，否則因揮發(fā)而失去殺菌能力。一般處理3～5分鐘，消毒時間亦因材料而異，處理種子用5～10分鐘。消毒后用無菌水沖洗，有時也可不必沖洗。3）酒精和其它消毒劑70%酒精也是常用的表面消毒液。將材料在酒精溶液中浸數(shù)秒鐘到一分鐘，然后水洗