【文章內(nèi)容簡介】 ：Series Ⅱwater Jacketed CO2 Incubator，THEROM 公司酶標儀：M680型，BIORAD公司紫外可見分光光度計：Ultrospec 3300pro型，Amersham公司可調(diào)微量加樣槍：THERMO公司其他儀器設(shè)備同第二部分實驗一（四）實驗方法1 藥物的制備同第二部分實驗一2 動物分組、造模和給藥同第二部分實驗一3 實驗評價指標及測定方法 （1）大鼠血清中睪酮（T）、雌二醇（E2）、T/E2水平的測定于末次次給藥24h后，內(nèi)眥眼眶取血，取血后靜置30min，血液凝固后，于4000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取上層血清測定T及E2含量。再計算出T/E2的水平。睪酮（T）測定原理：采用競爭法酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定。試劑盒中將抗NE抗體包被在微孔板上，酶聯(lián)親和物中含有標記了過氧化物酶的NE。實驗過程中，標準品、待測樣本中的NE與標記有酶聯(lián)親和物的NE共同競爭反應板上包被的抗NE抗體的定量結(jié)合位點。反應后沖洗掉為結(jié)合的部分，再加入底物反應，底物在酶的作用下變?yōu)樗{色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。通過比較待測樣本與NE標準品的吸光度，可準確測得樣本中的T含量。實驗過程：參考試劑盒說明書，按下列步驟進行：①試驗前將試劑盒及待測標本放置室溫1828℃平衡30min以上；②取出預包被抗體的微孔板，設(shè)立空白孔，依序加入100μl的標準品；③樣品編號，依序加入100μl的樣品上清液；④在標準品孔及待測樣本孔中分別加入50μl酶聯(lián)親和物，充分混勻；⑤37℃溫浴60min后，充分棄盡各孔內(nèi)液體，用稀釋好的洗滌液（1：10倍蒸餾水稀釋）反復沖洗5次并扣干孔內(nèi)剩余水分；⑥每孔依照次序，分別加入顯色液A、顯色液B各50μl，充分混勻，在室溫下避光反應15min； ⑦反應過后（正常情況下應為藍色并帶有明顯的梯度）每孔加入50μl的終止液，輕輕振蕩后充分混勻（正常情況下應轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色），終止反應；⑧顯色反應后在30min內(nèi)于酶標儀450nm處測定OD值；⑨根據(jù)標準曲線，計算T的含量。雌二醇（E2）的測定原理和實驗過程同睪酮（T）。（2）大鼠前列腺組織中丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）含量的測定1） 硝酸還原酶法測定大鼠前列腺組織中NO的含量硝酸還原酶法測定組織中NO的含量測定主要分兩步進行。第一步，測定組織中NO的吸光度；第二步，測定組織的蛋白含量。然后根據(jù)下式計算NO的含量：NO含量=（μmol/gprot）測定管吸光度空白管吸光度標準管吸光度空白管吸光度標準品濃度（20μmol/L*）樣本的蛋白含量（gprot/L）（20μmol/L）247。 注：*，相當5倍稀釋，所以此處標準濃度為20μmol/L。① 組織中NO吸光度的測定樣本準備：取大鼠前列腺組織，置于玻璃勻漿管中，加入適量的冰的生理鹽水進行勻漿，充分研磨，使腦組織勻漿化，制成10%的組織勻漿液，勻漿液2000rpm，離心10min，取上清，用以測定組織中NO的吸光度。另取10μl腦組織勻漿上清液用生理鹽水按1：9稀釋成1%的組織勻漿液，用以測定組織蛋白含量。測定原理：NO的化學性質(zhì)活潑，在體內(nèi)代謝很快轉(zhuǎn)化為硝酸鹽（NO3）和亞硝酸鹽（NO2），而NO2很快轉(zhuǎn)化為NO3，本法利用硝酸還原酶特異性將NO3還原為NO2，通過顯色深淺測定其濃度高低。實驗過程：試劑及其配制按試劑盒說明書進行，按下列表格進行操作：空白管標準管測定管雙蒸水（ml）100μmol/L標準應用液（ml）樣本（ml）混合試劑（ml）混勻，37℃準確水浴60min試劑三（ml）試劑四（ml）充分旋渦混勻30s，室溫靜置40min，35004000r/min，離心10min，取上清顯色上清（ml）顯色劑（ml）混勻，室溫靜置10min，蒸餾水調(diào)零，550nm，測各管吸光度值② 考馬斯亮蘭法測定組織的蛋白含量測定原理：蛋白質(zhì)分子具有NH3+基團，當棕紅色的考馬斯亮蘭顯色劑加入蛋白標準液或樣品中時，考馬斯亮蘭染料上的陰離子與蛋白NH3+結(jié)合，使溶液變?yōu)樗{色，通過測定吸光度可計算出蛋白含量。實驗過程：試劑及其配制按試劑盒說明書進行，按下列表格進行操作：空白管標準管測定管蒸餾水（ml）（ml）樣品（ml）考馬斯亮蘭顯色劑（ml）混勻，靜置10min，于595nm處，1cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測定各管吸光度值，并按下式計算蛋白含量（g/L）蛋白含量（g/l）=測定管吸光度空白管吸光度標準管吸光度空白管吸光度標準管濃度（g/L）2）大鼠前列腺組織中MDA的含量組織中MDA的含量測定主要分兩步進行。第一步，測定組織中MDA的吸光度；第二步，測定組織的蛋白含量。然后根據(jù)下式計算MDA的含量：MDA含量=（nmol/mgprot）測定管吸光度空白管吸光度標準管吸光度空白管吸光度標準品濃度（20nmol/L*）樣本的蛋白含量（mgprot/ml）（20μmol/L）247。 ① 組織中MDA吸光度的測定樣本準備：同1）部分中組織中NO吸光度的測定中的樣本準備測定原理：過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛（MDA）可與硫代巴比妥酸（TBA）* 縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532nm處有最大吸收峰。* 因底物為硫代巴比妥酸（Thibabituric Acid TBA）所以此法稱TBA法。實驗過程：試劑及其配制按試劑盒說明書進行，按下列表格進行操作：標準管標準空白管測定管測定空白管10nmol/ml標準品（ml）無水乙醇（ml）測試樣品（ml）試劑一（ml）混勻（搖動幾下試管架）試劑二（ml）3333試劑三（ml）11150%冰醋酸（ml）1漩渦混勻器混勻，試管口用保鮮膜扎緊，用針頭刺一小孔，95℃水浴40min，取出后流水冷卻，然后3500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘。取上清液，532nm處，1cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測各管吸光度值。（3）大鼠精囊濕重及其指數(shù)的測定：末次給藥24小時后，準確稱取大鼠體重后，處死大鼠，打開腹腔，取出精囊，稱其濕重。以兩側(cè)精囊總濕重/體重得出大鼠精囊指數(shù)。（4）腎指數(shù)和肝指數(shù)的測定：末次給藥24小時后，準確稱取大鼠體重后，處死大鼠，打開腹腔，取出腎臟和肝臟，分別稱其濕重。以兩腎總濕重/體重得出大鼠腎指數(shù)，以肝總濕重/體重得出大鼠肝指數(shù)。（5）腎HE染色：腎組織取出后，浸泡于福爾馬林中，石蠟包埋，切片，蘇木伊紅染色。4 統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)以 177。 S表示，用ttest檢驗差異的顯著性。二 結(jié)果（一）對去勢大鼠血清中睪酮（T）、雌二醇（E2）的影響 從下表可以看出，與空白組相比，模型組血清中睪酮的含量顯著升高（P），可能去皮下注射丙酸睪丸酮注射液有關(guān)，而雌二醇水平與空白組相比差異無統(tǒng)計學意義，表明在去勢條件下，通過皮下注射丙酸睪丸酮注射液，可使大鼠體內(nèi)睪酮含量顯著升高，而對雌二醇水平無明顯影響，使大鼠的前列腺組織在外源性雄激素的作用下出現(xiàn)增生。與模型組相比，愛普列特組、前列康組、益腎克癃方高劑量組均可顯著降低模型大鼠血清中的睪酮水平（P），益腎克癃方高劑量組大鼠血清中雌二醇水平與模型組相比顯著降低（P），與空白組相比也顯著降低（P）。實驗結(jié)果提示益腎克癃方抑制模型大鼠前列腺增生作用機制可能與其降低雄激素、雌激素水平有關(guān)，使模型大鼠體內(nèi)嚴重失衡的雌、雄激素比例得到改善，從而發(fā)揮抗前列腺增生作用。睪酮（T）的標準曲線：Y=+ R2=雌二醇（E2）的標準曲線：Y=+ R2=表25 對去勢大鼠血清中睪酮（T）、雌二醇（E2）的影響（ 177。 S，n=11）組別劑量（g/kg）睪酮（T,ng/ml）雌二醇（E2,pg/ml）空白組—177。177。模型組—177。**177。愛普列特組177。177。前列康組177。177。高劑量組177。**, 177。*,低劑量組177。177。注：與空白組比較，*P，** P；與模型組比較，P， P（二）對去勢大鼠前列腺組織中丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）含量的影響結(jié)果見表26：模型組與空白組相比大鼠前列腺組織中MDA含量無顯著性差異（P），且愛普列特組、前列康組、益腎克癃方高、低劑量阻與模型組、空白組比較也無顯著性差異（P）。提示前列腺增生并未引起前列腺組織的過氧化傷害。模型組與空白組相比大鼠前列腺組織中NO含量有顯著性差異（P），且愛普列特組、前列康組、益腎克癃方高、低劑量組劑量組與模型組比較也有顯著性差異（P）。提示丙酸睪丸酮致去勢大鼠前列腺增生的過程中對大鼠前列腺組織有損害作用，益腎克癃方可對抗這種傷害，并且益腎克癃方高、低劑量組的對抗作用均強于陽性對照藥愛普列特、前列康。表26 對去勢大鼠前列腺組織中MDA和NO的影響（ 177。 S，n=11）組別劑量（g/kg）MDA（μmol/gprot）NO（μmol/gprot）空白組—177。177。模型組—177。177。*愛普列特組177。177。前列康組177。177。高劑量組177。177。**,低劑量組177。177。*,注：與空白組比較，*P，** P；與模型組比較，P， P（三）對去勢大鼠精囊腺濕重及其指數(shù)的影響 結(jié)果表明，與空白組比較，模型組、愛普列特組、前列康組和2個劑量組精囊濕重和精囊指數(shù)均有明顯增加（P），因此認為，長期皮下注射丙酸睪丸酮形成前列腺增生模型的同時對大鼠精囊也產(chǎn)生了影響。表27 對去勢大鼠精囊濕重及其指數(shù)的影響（ 177。 S，n=11）組別劑量（g/kg）精囊濕重（g）精囊指數(shù)（mg/g）空白組—177。177。模型組—177。**177。**愛普列特組177。**,177。**,前列康組177。**177。**,高劑量組177。**177。**低劑量組177。**177。0. 92**注：與空白組比較，*P，** P；與模型組比較，P， P（四）對去勢大鼠腎臟指數(shù)和肝臟指數(shù)的影響 結(jié)果表明，與空白組比較，模型組、愛普列特組、前列康組和2個劑量組腎臟指數(shù)均有明顯增加（P），但肝臟指數(shù)各組之間均無明顯差異。表28 對去勢大鼠腎臟指數(shù)和肝臟指數(shù)的影響（ 177。 S，n=11）組別劑量（g/kg）腎臟指數(shù)（mg/g）肝臟指數(shù)（mg/g）空白組—177。177。模型組—177。**177。愛普列特組177。*177。前列康組177。**177。高劑量組177。**177。低劑量組177。0. 42**,177。注：與空白組比較，*P，** P；與模型組比較，P， P（五）對去勢大鼠腎臟組織形態(tài)學的影響正常大鼠腎臟組織切片經(jīng)HE染色后，腎組織正常，無異變（圖2A）。實驗性前列腺增生模型大鼠與正常大鼠比較，腎小管變性較明顯，腎病理改變不明顯（圖2B）。益腎克癃方高劑量組、低劑量組、愛普列特組、前列康組較模型組未明顯改善腎損傷（圖2C、D、E、F）。三 分析與討論（一）前列腺增生的作用機制前列腺增生癥在老年男性中多見，其病理特點為前列腺上皮細胞間質(zhì)增生，結(jié)締組織和平滑肌結(jié)節(jié)樣增生及腺泡囊性擴張，前列腺增生后向尿道內(nèi)突出，使前列腺部后尿道彎曲、延長、變細，并使膀胱頸部隆起突入膀胱，產(chǎn)生膀胱頸部的梗阻，從而使排尿阻力增加，膀胱殘余尿量增多，出現(xiàn)排尿不暢和夜尿增多等一系列癥狀。中醫(yī)認為這些癥狀乃由腎陽虛衰、膀胱水道瘀阻、氣化不利所致，治當以溫補腎陽、通利水道、化氣行水為要[20]。前列腺增生的生化機制目前尚不十分明確，一般認為主要有3條途徑[2122]：（1）雄激素途徑：雄性激素作用于前列腺基質(zhì)和上皮細胞，產(chǎn)生生長因子，引起腺體增生。（2）雌激素途徑：雌激素作用于前列腺間質(zhì)成纖維細胞、基質(zhì)上皮細胞，產(chǎn)生角質(zhì)生長因子EGF和bFGF及其受體，同時增加AR（雄激素受體，androgen receptor）數(shù)量及對雄激素刺激的敏感性，促進激發(fā)BPH。（3）生長因子途徑：雄激素和雌激素的作用都通過介導多種類的多肽生長因子來實現(xiàn)，生長因子有正調(diào)控因子和負調(diào)控因子，一旦分泌失調(diào)，正性因子增多，負性因子減少，則細胞增殖快于細胞凋亡，導致前列腺增生。且不管何種途徑，其作用的最終結(jié)果是由于雌、雄激素的失衡所致。（二）對性激素的影響前列腺為雄激素依賴器官，它的成長發(fā)育與功能的維持都需要睪丸供給適當水平的雄激素。雙側(cè)睪丸切除后前列腺萎縮、細胞凋亡，給予外源性睪酮后，前列腺又恢復正常狀態(tài)。故雄激素與前列腺增生密切相關(guān)。現(xiàn)代藥理研究證實，前列腺增生的發(fā)生與性激素平衡的失調(diào)有關(guān)，故檢測了血清中的丙酸睪酮的含量，以觀察對性激素平衡的影響。而雌激素在雄性體內(nèi)30％直接來自睪丸，70％由腎上腺和睪丸所產(chǎn)生的雄激素在外周的芳香化作用轉(zhuǎn)變而來[23]，這一在生理上與雄激素有著不同作用的性激素，在前列腺增生發(fā)生過程中所扮演的角色頗具爭議。不少研究者認為雌激素協(xié)同雄激素促進前列腺增生的發(fā)生[24,25]。按雌雄激素平衡失調(diào)理論，老年睪酮水平下降，雌激素水平相對升高，從而促進BPH的發(fā)生。這一理論己獲得不少資料的支持，如Walsh等[26]用17β雌二醇加3α雄甾烷二醇在3個月內(nèi)誘發(fā)去勢犬BP