【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ml 30%丙烯酰胺溶液 ml () ml 10%SDS ml 10%過硫酸銨 ml TEMED ml5% SDSPAGE 積層膠 ddH2O 30%丙烯酰胺溶液 mol/L Triscl() 10%SDS 10%過硫酸銨 TEMED 30%丙烯酰胺溶液 丙烯酰 亞甲雙丙烯酰胺 離子水（ddH2O） 10%過硫酸銨 1 g過硫酸銨溶解于10 ml的水中，于4℃貯存。室溫、避光保存。2XSDS凝膠加樣緩沖液4 X TrisHCl/SDS,() 25ml 甘油 [ 20%（W/V）] 20ml SDS [ 4%（W/V）] 4g 溴酚蘭 [ %（W/V）] 1mg 加ddH2O 至100 ml并混勻，等量分裝成1ml于70℃貯存。5 X Tris甘氨酸電泳緩沖液Tris堿 g Glycine（pH ） g SDS (電泳極) g 加ddH2O至1000 ml，使用時(shí)1：5稀釋，室溫貯存。0．25%考馬斯亮蘭R250染液 g，溶解在500 ml甲醇：水：冰乙酸=45：45：10（體積比）的溶液中，用whatman 1 號(hào)濾紙過濾，于室溫保存。高濃度脫色液 甲醇：水：冰乙酸=45：45：10（體積比）混勻于室溫貯存。 低濃度脫色液 甲醇：水：冰乙酸=3：1：6（體積比）混勻于室溫貯存。 8．1 mol/L DTT（二硫蘇糖醇）用20ml （） DTT，過濾除菌后分裝成1ml 小份貯存于20℃（二） 純化試劑 Buffer B (裂解液)磷酸二氫鈉 Tris堿 尿素 加ddH2O至1000 ml,。 Buffer C (洗液)磷酸二氫鈉 Tris堿 尿素 加ddH2O至1000 ml,。 Buffer E （洗脫液）磷酸二氫鈉 Tris堿 尿素 加ddH2O至1000 ml,。（三）Westernblot所需試劑 電轉(zhuǎn)液 1L Glycine Tris堿 SDS 甲醇 200ml 用ddH20 定容至1L 封閉液（5%脫脂奶粉） 脫脂奶粉 5g PBS 100ml1%BSABSA 1gPBS 100mlPBS ( ) 1L NaCl 8g KCl KH2PO4 ddH2O 800ml定容至1000ml (四) 細(xì)胞培養(yǎng)液生長(zhǎng)液：1X1640培養(yǎng)液 88% 胎牛血清 10% 雙抗（P、S） 1%% 維持液：DMEM液 96% 胎牛血清 2% 雙抗（P、S） 1%% ～(五)SB培養(yǎng)基及其所需試劑SB 培養(yǎng)基胰化蛋白胨 20g酵母提取物 10g 氯化鈉 10g加去離子水 950ml并攪拌使之完全溶解，用5mol/，定容至1L，高壓蒸汽滅菌(15磅，105 Pa)20～30 min，4℃保存。 （六） 其它常用溶液1mol/L HCl按以下順序混合 H2O 濃鹽酸10mol/L NaOH 將400g NaOH溶于450 ml水中，補(bǔ)加水到1L，高壓滅菌。 mol/L EDTA（乙二胺四乙酸）稱取186 g EDTA溶于800 ml去離子水中，補(bǔ)加水至1L，高壓滅菌。50%甘油50 ml甘油，加水至100 ml，高壓滅菌。10% SDS 在 900 ml水中溶解100 g SDS，加熱助溶，加入濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH ，加水定容至1L，分裝備用。 IPTG（異丙基硫代βD半乳糖苷）在8ml蒸餾水中溶解2gIPTG后，用蒸餾水定容至10ml，用濾膜過濾除菌，分裝成1ml小份，20℃貯存。1mol/L Tris在800ml 水中溶解 Tris堿，加入濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至所需值。 PH HCl 70ml 60ml 42ml應(yīng)使溶液冷至室溫方可最后調(diào)節(jié)pH值，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。乙二胺四乙酸鈉（EDTA）用去離子水溶解EDTA，%，高壓滅菌，分裝小瓶，于4oC冰箱保存。青/鏈霉素儲(chǔ)存液（10000U/mL青霉素和10mg/mL鏈霉素）稱取121mg(1650U/mg)的青霉素和200mg鏈霉素，溶于20mL去離子水中， 的濾膜濾過除菌，分裝并儲(chǔ)存于－20oC避光保存。使用時(shí)以1:100倍稀釋。四、主要儀器設(shè)備1. Heraeus Biofuge 17RS 型低溫高速離心機(jī)2. HITA CHI 低溫高速離心機(jī)3. TLT13V85V14 型超低溫冰箱4. Minsk 16E冰箱5. WS226179HW1型恒溫水浴箱6. 型恒溫培養(yǎng)箱7. ML902 型定時(shí)恒溫磁力攪拌器8. Microfuge Lite 離心機(jī)9. THZC 恒溫震蕩器10. BioRAD1000/500 型電泳儀11. ZF4 型紫外透射反射分析儀12. LIBROR HEL200型電子天平13. UV265 風(fēng)光光度計(jì)，Shimaduzu14. QL901 型旋渦混合15. YJ875 醫(yī)用凈化工作臺(tái)16. DTBI 型脫色搖床17. MilliQ 型純水器18. HW8B 型恒溫器19. 松下 NNK563S 微波爐實(shí)驗(yàn)方法一、大量誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白[42]將重組工程菌M15/pQE31hexon接種在含氨芐（100ug/ml）和卡那（50ug/ml）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)空白菌M15作對(duì)照，過夜培養(yǎng)。將菌液按1：50的比例轉(zhuǎn)接到800ml LB培養(yǎng)基中，加入IPTG(誘導(dǎo)劑)至終濃度為1mM進(jìn)行誘導(dǎo)，37℃，150轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)4小時(shí)，離心，6000rpm，10min，收集沉淀。同時(shí)取不加誘導(dǎo)劑的菌液作對(duì)照。加入2SDS上樣緩沖液，煮沸5分鐘，進(jìn)行SDSPAGE電泳，檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。二、六鄰體蛋白的純化（一）裂解細(xì)菌加入12ml Buffer B，充分混勻，裂解細(xì)菌，1h；輔助超聲，工作10s，停10s，功率400w，工作次數(shù)20；溶液澄清后，離心，12 000rpm，25min；收集上清液，以備純化；（二）大量純化目的蛋白 50% NiNTA 的混合物于12ml裂解液，室溫下?lián)u床振蕩60min；將裂解液樹脂混合物移入空的柱子；移去尾端帽，收集流出液；用8ml Buffer C洗去未結(jié)合NiNTA的蛋白；用8ml Buffer D洗脫目的蛋白；用4ml Buffer E洗脫目的蛋白；三、蛋白定量 Bradford法[43]標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用PBS配制結(jié)晶牛血清清蛋白（BSA）成10mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取7個(gè)EP管以10mg/ml的BSA為母液分別配制0，，，；另取7個(gè)EP管每管中加入300μl考馬斯亮藍(lán)G250試劑，并在各管分別加入以上濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液5μl，在室溫（20~25?C）下放置515min，通過蛋白質(zhì)－核酸微量檢測(cè)儀檢測(cè)。用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量（mg）為橫座標(biāo)，用吸光度值A(chǔ)595為縱座標(biāo)，作圖，即得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)出的未知樣品的A595值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管液作為空白對(duì)照液.樣品的測(cè)定：用上述同樣的方法，測(cè)定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。四、動(dòng)物免疫初次免疫 將500ug純化的重組人腺病毒六鄰體亞基蛋白與完全弗氏佐劑等體積混合，碾磨至油包水狀[44]。背部皮下注射新西蘭家兔，觀察記錄家兔的狀態(tài)變化.2周耳緣靜脈進(jìn)行采血，離心分離血清,分裝保存至20度冰箱中.加強(qiáng)免疫 第3周，以減半量(250ug)純化的重組人腺病毒六鄰體蛋白與不完全弗氏佐劑等體積混合,采用通過注射入腹腔的方法進(jìn)行加強(qiáng)免疫。觀察記錄家兔的狀態(tài)變化. 第4周耳緣靜脈采血，離心分離血清,分裝保存至20度冰箱中。檢測(cè)抗體效價(jià)。根據(jù)血清效價(jià)決定大量采血，第6周心臟采血，離心分離血清,分裝保存至20度冰箱中。五．重組蛋白抗原性鑒定（westernblot）：（一）抗原性鑒定安裝玻璃板配制12％的分離膠溶液，依次混合各成分。15%SDSPAGE分離膠 10 ml ddH2O ml 30%丙烯酰胺溶液 ml () ml 10%SDS ml 10%過硫酸銨 ml TEMED ml一旦加入TEMED，馬上開始聚合，故應(yīng)立即快速旋動(dòng)混和物并進(jìn)入下步操作。.速在兩玻璃板的間隙中灌注分離膠溶液，留出灌注積層膠的空間（梳子的尺長(zhǎng)再加一厘米）。用吸管小心的在分離膠溶液上蓋一層異丁醇。將凝膠垂直放于室溫。分離膠聚合完全后（30min），清出覆蓋液體，用去離子水洗滌凝膠頂部數(shù)次以除去未聚合的丙稀酰胺。盡可能除去凝膠上的液體，再用紙巾的邊緣吸凈殘留的液體。配制5％積層膠溶液，依次混合各成分。5% SDSPAGE 積層膠 3 mlddH2O 30%丙烯酰胺溶液 10%SDS mol/L Triscl() 10%過硫酸銨 TEMED 一旦加入TEMED，馬上開始聚合，故應(yīng)快速旋動(dòng)混合物并進(jìn)入下步操作。在已經(jīng)聚合的分離膠上直接灌注積層膠，立即在積層膠溶液中插入干凈的梳子。小心避免混入氣泡，將凝膠垂直的放于室溫下。積層膠發(fā)生聚合時(shí)，可以在樣品中加入2SDS凝膠加樣緩沖液，在100℃加熱10分鐘，使蛋白質(zhì)變性。積層膠聚合完全后（30分鐘），小心移出梳子，立即用去離子水洗滌加樣槽以除去未聚合的丙稀酰胺。按順序加樣，每加完一個(gè)樣品后在下槽緩沖液中洗滌加樣注射器。最后在所有不用的樣品孔中加入等體積的2SDS凝膠加樣緩沖液。將電泳裝置與電源連接（正極應(yīng)接下槽），凝膠上所加電壓為8V/cm。當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后，把電壓提高到15V/cm, 繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)達(dá)到底部，然后關(guān)閉電源。1從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮勺翹開玻璃板，將膠取下。1經(jīng)SDSPAGE電泳后，將凝膠與6層濾紙、NC膜浸泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液中，15分鐘。1修剪膜與濾紙使其與凝膠大小相等，半干轉(zhuǎn)印45分鐘。1轉(zhuǎn)印后取膜置于5%脫脂奶粉中，4oC過夜。1加入一抗：以封閉液1：2000稀釋兔血清為一抗，將膜浸泡于其中蓋上盒蓋，37oC緩慢搖動(dòng)，1小時(shí)。1漂洗：以PBS（）清洗NC膜15分鐘 3次。1加入二抗：以封閉液1：5000稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，將膜浸泡于其中蓋上盒蓋，37oC緩慢搖動(dòng)，1小時(shí)。1漂洗：以PBS（）清洗NC膜15分鐘 3次。1顯色：DAB顯色，在4mlSolution B中，滴入4mlSolution A清清搖動(dòng)，將NC膜浸入其中，觀察210分鐘，終止顯色，照相。（二）抗體效價(jià)檢測(cè)進(jìn)行SDS