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正文內(nèi)容

人3型腺病毒重組六鄰體蛋白的純化及免疫學(xué)研究doc(編輯修改稿)

2024-08-13 16:18 本頁面
 

【文章內(nèi)容簡介】 ml 30%丙烯酰胺溶液 ml () ml 10%SDS ml 10%過硫酸銨 ml TEMED ml5% SDSPAGE 積層膠 ddH2O 30%丙烯酰胺溶液 mol/L Triscl() 10%SDS 10%過硫酸銨 TEMED 30%丙烯酰胺溶液 丙烯酰 亞甲雙丙烯酰胺 離子水(ddH2O) 10%過硫酸銨 1 g過硫酸銨溶解于10 ml的水中,于4℃貯存。室溫、避光保存。2XSDS凝膠加樣緩沖液4 X TrisHCl/SDS,() 25ml 甘油 [ 20%(W/V)] 20ml SDS [ 4%(W/V)] 4g 溴酚蘭 [ %(W/V)] 1mg 加ddH2O 至100 ml并混勻,等量分裝成1ml于70℃貯存。5 X Tris甘氨酸電泳緩沖液Tris堿 g Glycine(pH ) g SDS (電泳極) g 加ddH2O至1000 ml,使用時(shí)1:5稀釋,室溫貯存。0.25%考馬斯亮蘭R250染液 g,溶解在500 ml甲醇:水:冰乙酸=45:45:10(體積比)的溶液中,用whatman 1 號濾紙過濾,于室溫保存。高濃度脫色液 甲醇:水:冰乙酸=45:45:10(體積比)混勻于室溫貯存。 低濃度脫色液 甲醇:水:冰乙酸=3:1:6(體積比)混勻于室溫貯存。 8.1 mol/L DTT(二硫蘇糖醇)用20ml () DTT,過濾除菌后分裝成1ml 小份貯存于20℃(二) 純化試劑 Buffer B (裂解液)磷酸二氫鈉 Tris堿 尿素 加ddH2O至1000 ml,。 Buffer C (洗液)磷酸二氫鈉 Tris堿 尿素 加ddH2O至1000 ml,。 Buffer E (洗脫液)磷酸二氫鈉 Tris堿 尿素 加ddH2O至1000 ml,。(三)Westernblot所需試劑 電轉(zhuǎn)液 1L Glycine Tris堿 SDS 甲醇 200ml 用ddH20 定容至1L 封閉液(5%脫脂奶粉) 脫脂奶粉 5g PBS 100ml1%BSABSA 1gPBS 100mlPBS ( ) 1L NaCl 8g KCl KH2PO4 ddH2O 800ml定容至1000ml (四) 細(xì)胞培養(yǎng)液生長液:1X1640培養(yǎng)液 88% 胎牛血清 10% 雙抗(P、S) 1%% 維持液:DMEM液 96% 胎牛血清 2% 雙抗(P、S) 1%% ~(五)SB培養(yǎng)基及其所需試劑SB 培養(yǎng)基胰化蛋白胨 20g酵母提取物 10g 氯化鈉 10g加去離子水 950ml并攪拌使之完全溶解,用5mol/,定容至1L,高壓蒸汽滅菌(15磅,105 Pa)20~30 min,4℃保存。 (六) 其它常用溶液1mol/L HCl按以下順序混合 H2O 濃鹽酸10mol/L NaOH 將400g NaOH溶于450 ml水中,補(bǔ)加水到1L,高壓滅菌。 mol/L EDTA(乙二胺四乙酸)稱取186 g EDTA溶于800 ml去離子水中,補(bǔ)加水至1L,高壓滅菌。50%甘油50 ml甘油,加水至100 ml,高壓滅菌。10% SDS 在 900 ml水中溶解100 g SDS,加熱助溶,加入濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH ,加水定容至1L,分裝備用。 IPTG(異丙基硫代βD半乳糖苷)在8ml蒸餾水中溶解2gIPTG后,用蒸餾水定容至10ml,用濾膜過濾除菌,分裝成1ml小份,20℃貯存。1mol/L Tris在800ml 水中溶解 Tris堿,加入濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至所需值。 PH HCl 70ml 60ml 42ml應(yīng)使溶液冷至室溫方可最后調(diào)節(jié)pH值,加水定容至1L,分裝后高壓滅菌。乙二胺四乙酸鈉(EDTA)用去離子水溶解EDTA,%,高壓滅菌,分裝小瓶,于4oC冰箱保存。青/鏈霉素儲存液(10000U/mL青霉素和10mg/mL鏈霉素)稱取121mg(1650U/mg)的青霉素和200mg鏈霉素,溶于20mL去離子水中, 的濾膜濾過除菌,分裝并儲存于-20oC避光保存。使用時(shí)以1:100倍稀釋。四、主要儀器設(shè)備1. Heraeus Biofuge 17RS 型低溫高速離心機(jī)2. HITA CHI 低溫高速離心機(jī)3. TLT13V85V14 型超低溫冰箱4. Minsk 16E冰箱5. WS226179HW1型恒溫水浴箱6. 型恒溫培養(yǎng)箱7. ML902 型定時(shí)恒溫磁力攪拌器8. Microfuge Lite 離心機(jī)9. THZC 恒溫震蕩器10. BioRAD1000/500 型電泳儀11. ZF4 型紫外透射反射分析儀12. LIBROR HEL200型電子天平13. UV265 風(fēng)光光度計(jì),Shimaduzu14. QL901 型旋渦混合15. YJ875 醫(yī)用凈化工作臺16. DTBI 型脫色搖床17. MilliQ 型純水器18. HW8B 型恒溫器19. 松下 NNK563S 微波爐 實(shí)驗(yàn)方法一、大量誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白[42]將重組工程菌M15/pQE31hexon接種在含氨芐(100ug/ml)和卡那(50ug/ml)的培養(yǎng)基中培養(yǎng),同時(shí)設(shè)空白菌M15作對照,過夜培養(yǎng)。將菌液按1:50的比例轉(zhuǎn)接到800ml LB培養(yǎng)基中,加入IPTG(誘導(dǎo)劑)至終濃度為1mM進(jìn)行誘導(dǎo),37℃,150轉(zhuǎn)/分鐘,培養(yǎng)4小時(shí),離心,6000rpm,10min,收集沉淀。同時(shí)取不加誘導(dǎo)劑的菌液作對照。加入2SDS上樣緩沖液,煮沸5分鐘,進(jìn)行SDSPAGE電泳,檢測蛋白表達(dá)情況。二、六鄰體蛋白的純化(一)裂解細(xì)菌加入12ml Buffer B,充分混勻,裂解細(xì)菌,1h;輔助超聲,工作10s,停10s,功率400w,工作次數(shù)20;溶液澄清后,離心,12 000rpm,25min;收集上清液,以備純化;(二)大量純化目的蛋白 50% NiNTA 的混合物于12ml裂解液,室溫下?lián)u床振蕩60min;將裂解液樹脂混合物移入空的柱子;移去尾端帽,收集流出液;用8ml Buffer C洗去未結(jié)合NiNTA的蛋白;用8ml Buffer D洗脫目的蛋白;用4ml Buffer E洗脫目的蛋白;三、蛋白定量 Bradford法[43]標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:用PBS配制結(jié)晶牛血清清蛋白(BSA)成10mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定:取7個(gè)EP管以10mg/ml的BSA為母液分別配制0,,,;另取7個(gè)EP管每管中加入300μl考馬斯亮藍(lán)G250試劑,并在各管分別加入以上濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液5μl,在室溫(20~25?C)下放置515min,通過蛋白質(zhì)-核酸微量檢測儀檢測。用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量(mg)為橫座標(biāo),用吸光度值A(chǔ)595為縱座標(biāo),作圖,即得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)測出的未知樣品的A595值,即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管液作為空白對照液.樣品的測定:用上述同樣的方法,測定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。四、動物免疫初次免疫 將500ug純化的重組人腺病毒六鄰體亞基蛋白與完全弗氏佐劑等體積混合,碾磨至油包水狀[44]。背部皮下注射新西蘭家兔,觀察記錄家兔的狀態(tài)變化.2周耳緣靜脈進(jìn)行采血,離心分離血清,分裝保存至20度冰箱中.加強(qiáng)免疫 第3周,以減半量(250ug)純化的重組人腺病毒六鄰體蛋白與不完全弗氏佐劑等體積混合,采用通過注射入腹腔的方法進(jìn)行加強(qiáng)免疫。觀察記錄家兔的狀態(tài)變化. 第4周耳緣靜脈采血,離心分離血清,分裝保存至20度冰箱中。檢測抗體效價(jià)。根據(jù)血清效價(jià)決定大量采血,第6周心臟采血,離心分離血清,分裝保存至20度冰箱中。五.重組蛋白抗原性鑒定(westernblot):(一)抗原性鑒定安裝玻璃板配制12%的分離膠溶液,依次混合各成分。15%SDSPAGE分離膠 10 ml ddH2O ml 30%丙烯酰胺溶液 ml () ml 10%SDS ml 10%過硫酸銨 ml TEMED ml一旦加入TEMED,馬上開始聚合,故應(yīng)立即快速旋動混和物并進(jìn)入下步操作。.速在兩玻璃板的間隙中灌注分離膠溶液,留出灌注積層膠的空間(梳子的尺長再加一厘米)。用吸管小心的在分離膠溶液上蓋一層異丁醇。將凝膠垂直放于室溫。分離膠聚合完全后(30min),清出覆蓋液體,用去離子水洗滌凝膠頂部數(shù)次以除去未聚合的丙稀酰胺。盡可能除去凝膠上的液體,再用紙巾的邊緣吸凈殘留的液體。配制5%積層膠溶液,依次混合各成分。5% SDSPAGE 積層膠 3 mlddH2O 30%丙烯酰胺溶液 10%SDS mol/L Triscl() 10%過硫酸銨 TEMED 一旦加入TEMED,馬上開始聚合,故應(yīng)快速旋動混合物并進(jìn)入下步操作。在已經(jīng)聚合的分離膠上直接灌注積層膠,立即在積層膠溶液中插入干凈的梳子。小心避免混入氣泡,將凝膠垂直的放于室溫下。積層膠發(fā)生聚合時(shí),可以在樣品中加入2SDS凝膠加樣緩沖液,在100℃加熱10分鐘,使蛋白質(zhì)變性。積層膠聚合完全后(30分鐘),小心移出梳子,立即用去離子水洗滌加樣槽以除去未聚合的丙稀酰胺。按順序加樣,每加完一個(gè)樣品后在下槽緩沖液中洗滌加樣注射器。最后在所有不用的樣品孔中加入等體積的2SDS凝膠加樣緩沖液。將電泳裝置與電源連接(正極應(yīng)接下槽),凝膠上所加電壓為8V/cm。當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后,把電壓提高到15V/cm, 繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)達(dá)到底部,然后關(guān)閉電源。1從電泳裝置上卸下玻璃板,用刮勺翹開玻璃板,將膠取下。1經(jīng)SDSPAGE電泳后,將凝膠與6層濾紙、NC膜浸泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液中,15分鐘。1修剪膜與濾紙使其與凝膠大小相等,半干轉(zhuǎn)印45分鐘。1轉(zhuǎn)印后取膜置于5%脫脂奶粉中,4oC過夜。1加入一抗:以封閉液1:2000稀釋兔血清為一抗,將膜浸泡于其中蓋上盒蓋,37oC緩慢搖動,1小時(shí)。1漂洗:以PBS()清洗NC膜15分鐘 3次。1加入二抗:以封閉液1:5000稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,將膜浸泡于其中蓋上盒蓋,37oC緩慢搖動,1小時(shí)。1漂洗:以PBS()清洗NC膜15分鐘 3次。1顯色:DAB顯色,在4mlSolution B中,滴入4mlSolution A清清搖動,將NC膜浸入其中,觀察210分鐘,終止顯色,照相。(二)抗體效價(jià)檢測進(jìn)行SDS
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