【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 物設(shè)計(jì)　　PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5′端引物與位于待擴(kuò)增片段5′端上游的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴(kuò)增片段3′端的一小段DNA序列互補(bǔ)。 　　引物設(shè)計(jì)的基本原則 　?、僖镩L(zhǎng)度：1530bp，常用為20bp左右。 　?、谝飰A基：G+C含量以4060%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 　?、垡飪?nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。 　?、軆蓚€(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3 ′端的互補(bǔ)重疊。 　　⑤引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過(guò)70%，引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。 　?、抟?‘端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，最佳選擇是G和C。 　　⑦引物的5 ′端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。 　　v 引物設(shè)計(jì)軟件 　　Primer （自動(dòng)搜索）* 　　vOligo6 （引物評(píng)價(jià)） 　　vVector NTI Suit 　　vDNAsis 　　vOmiga 　　vDNAstar 　　vPrimer3 （在線服務(wù)） 模板的制備　　PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。 　　模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對(duì)象，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌、真菌等。也可以是病理生理標(biāo)本如細(xì)胞、血液、羊水細(xì)胞等。法醫(yī)學(xué)標(biāo)本有血斑、精斑、毛發(fā)等。 　　標(biāo)本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標(biāo)本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過(guò)SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細(xì)菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA，經(jīng)酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板。 PCR反應(yīng)條件的控制　　①PCR反應(yīng)的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子 　?、阪V離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，　?、鄣孜餄舛?dNTP以等摩爾濃度配制，20～200umol/L 　?、躎aqDNA聚合酶 （100ul） 　?、菀? ～ 　?、薹磻?yīng)溫度和循環(huán)次數(shù) 　　變性溫度和時(shí)間 95℃，30s 　　退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃ 　　延伸溫度和時(shí)間 72℃，1min/kb（10kb內(nèi)） 　　Tm值=4(G+C) ＋2(A+T) 　　循環(huán)次數(shù) :一般為25 ～ 30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的 擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無(wú)限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右，循環(huán)數(shù)超過(guò)30個(gè)以后，DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺(tái)期”。 [編輯本段]［PCR步驟］　　標(biāo)準(zhǔn)的PCR過(guò)程分為三步： 　　（90℃96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈DNA 　?。?5℃65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。 　?。?0℃75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。 　　每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。如圖所示： 　　現(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60℃65℃間進(jìn)行，以減少一次升降溫過(guò)程，提高了反應(yīng)速度。 [編輯本段]［PCR檢測(cè)］　　PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了高的拷貝數(shù)，下一步檢測(cè)就成了關(guān)鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是最常用的檢測(cè)手段。電泳法檢測(cè)特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因?yàn)槠浜?jiǎn)捷易行，成為了主流檢測(cè)方法。近年來(lái)以熒光探針為代表的檢測(cè)方法，有逐漸取代電泳法的趨勢(shì)。 [編輯本段]［PCR反應(yīng)特點(diǎn)］特異性強(qiáng)　　PCR反應(yīng)的特異性決定因素為： 　　①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合； 　?、趬A基配對(duì)原則； 　?、跿aq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性； 　?、馨谢虻奶禺愋耘c保守性。 　　其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。 靈敏度高　　PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=1012)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(μg=6)水平。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。 簡(jiǎn)便、快速　　PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性退火延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。 對(duì)標(biāo)本的純度要求低　　不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板。可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測(cè)。 [編輯本段]［PCR的循環(huán)參數(shù)］預(yù)變性（Initial denaturation）　　． 　　模板DNA完全變性與PCR酶的完全激活對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時(shí)間參考試劑說(shuō)明書(shū)，一般未修飾的Taq酶激活時(shí)間為兩分鐘。 循環(huán)中的變性步驟　　循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可 縮短該步驟時(shí)間 　　變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)損害酶活性，過(guò)短靶序列變性不徹底，易造成擴(kuò)增失敗。 引物退火（Primer annealing）　　退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴(kuò)增的長(zhǎng)度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。 　　退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響。 引物延伸　　引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶最適溫度）。但在擴(kuò)增長(zhǎng)度較短且退火溫度較高時(shí)，本步驟可省略 　　延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定，一般推薦在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1min/kbp。 循環(huán)數(shù)　　大多數(shù)PCR含2540循環(huán)，過(guò)多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。 最后延伸　　在最后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持515分鐘．使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。 　?。ㄋ模㏄CR中的污染和假陽(yáng)性 　　PCR中污染主要來(lái)自 　　樣品間交叉污染； 　　先前PCR產(chǎn)物遺留（carryover） [編輯本段][PCR儀器]　　pcr儀器的發(fā)展 　　pcr溫度循環(huán)至關(guān)重要，pcr擴(kuò)增儀各參數(shù)必須準(zhǔn)確。自perkin –elmercetus公司第一臺(tái)pcr擴(kuò)增儀問(wèn)世以來(lái)，現(xiàn)已有幾十家不同的廠家在國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)和銷售pcr擴(kuò)增儀。在短短的幾年間，擴(kuò)增儀經(jīng)過(guò)幾代的發(fā)展，不斷采用新技術(shù)，并且進(jìn)一步朝方便、實(shí)用、高智能化和自動(dòng)化的方向發(fā)展。 　　為了便于了解和選購(gòu)適宜的pcr實(shí)驗(yàn)設(shè)備，現(xiàn)將部分國(guó)內(nèi)外pcr擴(kuò)增儀列表如下；這些儀器主要用變溫鋁塊、變溫水浴及變溫氣流的方式達(dá)到熱循環(huán)的目的，各有其優(yōu)缺點(diǎn)。國(guó)產(chǎn)1109型dna擴(kuò)增儀則是用恒溫浴機(jī)械手移位式。更接近于手工操作。ptc51a/b體積小，智能化與自動(dòng)化程序高，可以兼做套式pcr，方便實(shí)用。以上各種儀器一般都配有微電腦自動(dòng)控制溫度、時(shí)間及循環(huán)數(shù)，可以達(dá)到節(jié)省勞動(dòng)力的目的。在采用這些儀器作pcr試驗(yàn)之前，一般均應(yīng)實(shí)測(cè)管內(nèi)溫度變化循環(huán)情況，以了解升、降溫時(shí)管內(nèi)因熱傳導(dǎo)造成的溫度滯后情況和實(shí)際到達(dá)的最高、最低溫度，用于修正設(shè)計(jì)的循環(huán)參數(shù)。溫度滯后受到所用eppendorf管材料、壁厚及形狀（與鋁塊孔匹配程度）的影響，這對(duì)變溫鋁塊式儀器影響更大些。對(duì)于配用制冷機(jī)式半導(dǎo)體元件致冷的儀器，在使用低于室溫的溫度來(lái)保冷pcr反應(yīng)后小管時(shí)，應(yīng)注意冷凝水的問(wèn)題，勿使流入儀器內(nèi)浸濕半導(dǎo)體元件而損壞儀器。 　　國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)的幾種dna擴(kuò)增儀 　　1109型 　　北京新技術(shù)所與軍科院聯(lián)合 　　機(jī)械臂 　　變溫水浴 　　電子調(diào)溫 　　40 　　16400元/臺(tái) 　　90a/b型 　　中科院遺傳所 　　機(jī)械臂 　　變溫水浴 　　電熱 　　14000元/臺(tái) 　　ptc51a/b型 　　軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 　　變溫氣流 　　電子調(diào)兼作套式 　　30 　　12000元/臺(tái) 　　dna thermal cycler 　　perkin –elmercetus(美) 　　變溫鋁塊 　　壓縮機(jī)致冷 　　48 　　us $ 　　thermocycler 　　＃60 　?。?0 　?。?80 　　b..braun 　　biotech 　　(德) 　　變溫水浴98℃四檔 　　電熱,自來(lái)水冷卻 　　60 　　100 　　180 　　dm 　　automatic temperature cycler single block t