【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 L，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表Tab. 18，%（g/g）。表18 五子衍宗方中金絲桃苷含量測(cè)定結(jié)果Sample123456Sample weight（g）Content（％）Average content（％）RSD%二、菟絲子及五子衍宗方大鼠血漿藥代動(dòng)力學(xué)研究本研究通過(guò)建立RPHPLC法，以金絲桃苷為指標(biāo)成分，對(duì)五子衍宗方藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了可行性研究。測(cè)定了五子衍宗方80％乙醇提取物，菟絲子80％乙醇提取物，及純品金絲桃苷大鼠腹腔給藥后，不同時(shí)間的血漿藥物濃度。并以中國(guó)藥理學(xué)會(huì)數(shù)學(xué)藥理專(zhuān)業(yè)委員會(huì)編制的3P87軟件處理時(shí)間－平均血藥濃度數(shù)據(jù)，以擬合優(yōu)度（goodness of fit）和AIC判斷曲線(xiàn)擬和程度，選擇房室模型，計(jì)算得到了藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器設(shè)備 藥品及試劑 金絲桃苷對(duì)照品 本所植化室提供，純度達(dá)95%以上五子衍宗方藥材 （菟絲子、枸杞子車(chē)前子、覆盆子、五味子） 購(gòu)自北京同仁堂藥店無(wú)水乙醇（分析純） 北京化工廠(chǎng)肝素鈉 常州新華活性材料研究所 磷酸（分析純） 北京化工廠(chǎng)丙二醇（分析純） 北京化工廠(chǎng)乙腈（色譜純） Fisher公司產(chǎn)品；甲醇（色譜純） 江蘇淮安塑料制品廠(chǎng)；雙蒸水 北京協(xié)和藥廠(chǎng)；氯化鈉注射液 石家莊制藥集團(tuán)。 動(dòng)物 Wistar 雄性大鼠 200220g，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所動(dòng)物中心，許可證編號(hào)：SCXK11000010Waters 2690高效液相色譜儀及996PDA型檢測(cè)器，北京醫(yī)用離心機(jī)廠(chǎng)制造的LD52A離心機(jī)，江蘇醫(yī)療器械廠(chǎng)制造的液體快速混合器，微量移液器（20200mL,德國(guó)Fisherbrand）2色譜條件的選擇 根據(jù)金絲桃苷的紫外吸收，對(duì)254nm和355nm兩波長(zhǎng)進(jìn)行了考察。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在254nm下，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)金絲桃苷有較強(qiáng)的干擾作用。在五子衍宗方中測(cè)定金絲桃苷含量時(shí)采用了254nm，目的是消除其他組分的干擾，但在大鼠腹腔注射五子衍宗方乙醇提取物后取得的血漿樣品中，由于復(fù)方的干擾組分進(jìn)入血漿中含量較低，對(duì)血漿中金絲桃苷主峰未有影響，而內(nèi)源性物質(zhì)在254nm下確對(duì)主峰干擾較大，因此在五子衍宗方藥代動(dòng)力學(xué)研究中亦選取355nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。 參考“第二章 菟絲子及五子衍宗方金絲桃苷含量的測(cè)定”中優(yōu)選的流動(dòng)相條件，%磷酸水溶液（40：5：55）為流動(dòng)相，對(duì)金絲桃苷純品、菟絲子乙醇提取物和五子衍宗方乙醇提取物大鼠腹腔給藥后血漿中金絲桃苷的色譜條件進(jìn)行了考察。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠腹腔注射五子衍宗方提取物的血漿樣品，在給藥40min后出現(xiàn)代謝產(chǎn)物，在上述流動(dòng)相條件下，與金絲桃苷不能實(shí)現(xiàn)基線(xiàn)分離，%磷酸水溶液（40：5：55）基礎(chǔ)上，進(jìn)行了流動(dòng)相比例的調(diào)整，%磷酸水溶液（16：14：70）流動(dòng)相下，金絲桃苷與五子衍宗方中的代謝產(chǎn)物成分實(shí)現(xiàn)基線(xiàn)分離。圖10 Wistar大鼠腹腔注射菟絲子80%乙醇提取物40分后血漿的HPLC圖tR= 金絲桃苷（流動(dòng)相：甲醇–%磷酸＝40：5：55）圖11 Wistar大鼠腹腔注射五子衍宗方80%乙醇提取物40分后血漿的HPLC圖tR= 金絲桃苷（流動(dòng)相：甲醇–%磷酸＝16：14：70） 根據(jù)內(nèi)標(biāo)選擇的原則，選擇理化性質(zhì)與金絲桃苷相近的化合物。對(duì)野黃芩苷、蘆丁等20多種物質(zhì)進(jìn)行了測(cè)試，未找到符合條件的內(nèi)標(biāo)物。曾經(jīng)澤在《生物藥物分析》中指出，一定要明確不是所有內(nèi)標(biāo)法都能提高分析結(jié)果的精密度，在某些情況下，如樣品沉淀蛋白后直接進(jìn)樣、柱切換進(jìn)樣，外標(biāo)法反而比內(nèi)標(biāo)法好且省事，即使樣品經(jīng)萃取處理，如內(nèi)標(biāo)選擇不合適，同樣外標(biāo)法會(huì)比內(nèi)標(biāo)法好。由于未找到合適的內(nèi)標(biāo)，樣品處理又采用甲醇沉淀蛋白后直接進(jìn)樣，在這種情況下本論文采用外標(biāo)法進(jìn)行定量計(jì)算。 色譜條件 根據(jù)“”和“”項(xiàng)下篩選的波長(zhǎng)和流動(dòng)相，對(duì)金絲桃苷純品、菟絲子提取物和五子衍宗方提取物大鼠腹腔給藥后的血漿樣品分別采取的色譜條件如下：色譜柱：Alltech C18柱（5μm，250mm ）流動(dòng)相Ⅰ：%磷酸水溶液（40：5：55）適用于金絲桃苷和菟絲子乙醇提取物大鼠腹腔給藥的藥代動(dòng)力學(xué)研究。流動(dòng)相Ⅱ：%磷酸水溶液（16：14：70）適用于五子衍宗方乙醇提取物大鼠腹腔給藥的藥代動(dòng)力學(xué)研究。流速： ，檢測(cè)波長(zhǎng)355nm。在上述色譜條件下，空白血漿、（流動(dòng)相Ⅰ） ，（流動(dòng)相Ⅱ）。結(jié)果顯示金絲桃苷純品，以及菟絲子提取物和五子衍宗方提取物中的色譜峰均不受內(nèi)源性雜質(zhì)峰的干擾，測(cè)定的專(zhuān)屬性強(qiáng)。圖12 HPLC圖圖13 空白血漿加金絲桃苷的HPLCDAD圖tR= 金絲桃苷（流動(dòng)相：甲醇–%磷酸＝16：14：70）圖14空白血漿加金絲桃苷的HPLCDAD圖tR= 金絲桃苷（流動(dòng)相：甲醇–%磷酸＝40：5：55）圖15 Wistar大鼠腹腔注射金絲桃苷40分后血漿的HPLC DAD圖（流動(dòng)相：甲醇–%磷酸＝40：5：55）圖16 Wistar大鼠腹腔注射菟絲子80%乙醇提取物40分后血漿的HPLCDAD圖（流動(dòng)相：甲醇–%磷酸＝40：5：55）3 血漿樣品預(yù)處理方法的選擇 提取條件及提取溶劑選擇 采用蛋白沉淀試劑沉淀血漿蛋白，過(guò)濾后直接進(jìn)樣和混合溶劑（含蛋白沉淀劑）沉淀蛋白，上清液吹干復(fù)溶進(jìn)樣比較。（1） 沉淀蛋白過(guò)濾后直接進(jìn)樣蛋白沉淀試劑選擇對(duì)金絲桃苷溶解性較好的甲醇、乙醇、丙酮和乙腈。提取方法為：以含有金絲桃苷 （），渦流震蕩1min。超聲提取10min，3000轉(zhuǎn)/min離心10min(分離有機(jī)相中的蛋白)，取上清液，微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣30181。l。所測(cè)得金絲桃苷色譜峰面積，與標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣分析所得峰面積值對(duì)比，提取率見(jiàn)表19。表19 不同蛋白沉淀試劑對(duì)金絲桃苷的提取率Deproteined SolventCH3OHC2H5OHCH3COCH3CH3CNExtract percent(%)71653534（2） 上清液吹干復(fù)溶進(jìn)樣 考察了甲醇和乙酸乙酯混合溶劑沉淀蛋白后氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)鼜?fù)溶進(jìn)樣，比較了甲醇與乙酸乙酯2:1，1:1和1:2不同比例下的提取率。 提取方法為：以含有金絲桃苷 （），加入3ml溶劑，渦流震蕩1min，3000轉(zhuǎn)/min離心10min，取上清液，氮?dú)獯蹈扇軇瑲堅(jiān)?00181。l甲醇復(fù)溶，微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣30181。l。所測(cè)得金絲桃苷色譜峰面積，與標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣分析所得峰面積值對(duì)比。提取率見(jiàn)表20。表20 不同比例甲醇乙酸乙酯混合溶劑對(duì)血漿中金絲桃苷的提取率比較Extract solvent（MeOH：EtOAc）2: 11: 11: 2Extract percent(%)676054綜合比較兩種方法，甲醇沉淀蛋白后直接進(jìn)樣，方法簡(jiǎn)單，回收率相對(duì)較高，因此以其作為血漿中金絲桃苷的提取方法。根據(jù)“ 提取條件及提取溶劑”項(xiàng)下，血漿樣品的處理方法為：， Epphendorf 塑料管中，渦流振蕩3min，混勻，離心10min（3000轉(zhuǎn)/min），取上層溶液，取濾液30μL進(jìn)行HPLC分析。4 方法學(xué)考察 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與線(xiàn)性范圍 ，置于1mL Epphendorf塑料管中，加入金絲桃苷系列標(biāo)準(zhǔn)溶液300μL，，，，按照“”項(xiàng)下操作，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以血漿中待測(cè)物濃度（C）為橫坐標(biāo)，待測(cè)物的峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸計(jì)算，求得直線(xiàn)回歸方程，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以流動(dòng)相Ⅰ：