細(xì)胞庫建立標(biāo)準(zhǔn)[詳(編輯修改稿)
2025-08-11 02:06 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 敏感細(xì)胞，培養(yǎng)后檢測。根據(jù)待檢細(xì)胞的種屬來源，須使用不同的敏感細(xì)胞進(jìn)行感染性試驗(yàn)。 這三種方法具有不同的檢測特性及靈敏度，因此應(yīng)采用不同的方法聯(lián)合檢測。若逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢測陽性時(shí)，建議進(jìn)行透射電鏡檢查或感染性試驗(yàn)，以確證是否存在感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。 小鼠來源和其他嚙齒類來源的細(xì)胞系或其雜交瘤細(xì)胞系有可能攜帶潛在的逆轉(zhuǎn)錄病毒。因此，對(duì)于人一鼠雜交瘤細(xì)胞系則應(yīng)進(jìn)行特異性逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測。如用于單克隆抗體生產(chǎn)的小鼠細(xì)胞系，則可不檢測特異性的逆轉(zhuǎn)錄病毒，但在生產(chǎn)工藝中應(yīng)增加病毒滅活程序。 (5)特殊外源病毒因子的檢測 應(yīng)對(duì)MCB細(xì)胞或WCB細(xì)胞進(jìn)行特殊病毒的檢測。檢測病毒的種類應(yīng)根據(jù)細(xì)胞系／株種屬、組織來源等確定。 如鼠源的細(xì)胞系，可采用小鼠、大鼠和倉鼠抗體產(chǎn)生試驗(yàn)，檢測其種特異病毒。 人源的細(xì)胞系／株，則應(yīng)檢測如人鼻咽癌病毒、人巨細(xì)胞病毒、人逆轉(zhuǎn)錄病毒、人乙型肝炎病毒、人丙型肝炎病毒。在某些情況下，也可能進(jìn)行轉(zhuǎn)化病毒的檢測，如人乳頭瘤病毒、腺病毒及人單純皰疹病毒。這些病毒的檢測可采用適當(dāng)?shù)捏w外檢測技術(shù)。 5．致瘤性檢查 某些傳代細(xì)胞系已證明具有致瘤性，如來源于嚙齒類的細(xì)胞系BHK2CHO、C127胞等，或細(xì)胞類型屬致瘤性細(xì)胞，如雜交瘤細(xì)胞，則可不必做致瘤性檢查。 某些傳代細(xì)胞系已證明在一定代次內(nèi)不具有致瘤性，而超過某代次則具有致瘤性，如Vero細(xì)胞，則必須進(jìn)行致瘤性檢查。 人上皮細(xì)胞系、人二倍體細(xì)胞株及所有用于活病毒疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞系／株應(yīng)進(jìn)行致瘤性檢查。另外，新建細(xì)胞系／株必須進(jìn)行致瘤性檢查。 在某些情況下，用于人體細(xì)胞治療及基因治療的細(xì)胞也須進(jìn)行致瘤性檢查。 將來源于MCB細(xì)胞或WCB細(xì)胞的增殖到或超過生產(chǎn)用體外細(xì)胞齡限制代次，再進(jìn)行致瘤性試驗(yàn)。 下述兩種致腫瘤性試驗(yàn)方法可任選其一： ①裸鼠至少10只，將細(xì)胞懸浮于適量無血清培養(yǎng)基中，使細(xì)胞濃度為每lml含510 7個(gè)細(xì)胞，每只裸鼠皮下注射或肌內(nèi)注射O．2ml；同時(shí)用Hela細(xì)胞或HeP2細(xì)胞設(shè)立陽性對(duì)照，陽性對(duì)照組至少10只，每只注射0．2ml含10 6個(gè)細(xì)胞；可用人二倍體細(xì)胞株作為陰性對(duì)照，陰性對(duì)照組至少10只，每只注射0．2ml含10 7個(gè)細(xì)胞。 ②新生小鼠(3～5日齡)，8～lOg小鼠10只，在出生后第0天、2天、7天和第14天，分別用O．1ml抗胸腺血清(ATS)或球蛋白處理，然后同上每只皮下接種10 7個(gè)活細(xì)胞。并設(shè)立陽性對(duì)照組，對(duì)照組至少接種10只。 結(jié)果判定： ①定期觀察并觸摸注射部位有無結(jié)節(jié)形成，且形成的任何結(jié)節(jié)均應(yīng)進(jìn)行雙向測量并記錄。 ②陽性對(duì)照組至少有9只有進(jìn)行性腫瘤生長時(shí)，試驗(yàn)視為有效。 ③如試驗(yàn)組動(dòng)物有進(jìn)行性生長的結(jié)節(jié)或可疑病灶，應(yīng)觀察至少1～2周；若出現(xiàn)的結(jié)節(jié)在觀察期內(nèi)開始消退，則應(yīng)在結(jié)節(jié)完全消退前，處死動(dòng)物并進(jìn)行解剖做病理及組織學(xué)檢查。 ④未發(fā)生結(jié)節(jié)的動(dòng)物，半數(shù)動(dòng)物應(yīng)觀察21天，剖檢，另外半數(shù)動(dòng)物應(yīng)觀察12周，進(jìn)行病理檢查，剖檢接種部位，觀察各淋巴結(jié)和各器官有無結(jié)節(jié)形成，如有懷疑，進(jìn)行病理組織檢查，不應(yīng)有轉(zhuǎn)移瘤形成。除上述體內(nèi)法外，也可采用軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)或器官培養(yǎng)試驗(yàn)等體外法檢測，特別適用于低代次時(shí)，動(dòng)物體內(nèi)無致瘤性的傳代細(xì)胞系。 (四)生產(chǎn)用細(xì)胞培養(yǎng) 生產(chǎn)用原材料的選擇和細(xì)胞操作環(huán)境，應(yīng)符合本規(guī)程一、(二)細(xì)胞庫的建立中有關(guān)規(guī)定。 從凍存的WCB中取出一支或多支安瓿，混合后培養(yǎng)，傳至一定代次后供生產(chǎn)用。其代次不得超過該細(xì)胞用于生產(chǎn)的最高限定代次。從WCB取出的細(xì)胞種子增殖的細(xì)胞不得再回凍保存或再用于生產(chǎn)。 體外培養(yǎng)細(xì)胞齡的計(jì)算 二倍體細(xì)胞齡以細(xì)胞群體倍增(Population Doubling)計(jì)算，以每個(gè)培養(yǎng)容器細(xì)胞群體細(xì)胞數(shù)為基礎(chǔ)，每增加一倍作為一世代，即一瓶細(xì)胞傳二瓶(1：2分種率)，再長滿瓶為一世代；一瓶傳四瓶(1：4)為二世代；一瓶傳八瓶(1：8)則為三世代。生產(chǎn)用細(xì)胞齡限制在細(xì)胞壽命期限的前2／3內(nèi)。傳代細(xì)胞系則以一定稀釋倍數(shù)進(jìn)行傳代，每傳一次為一代。二、連續(xù)傳代細(xì)胞系的特殊要求 傳代細(xì)胞系一般是由人或動(dòng)物腫瘤組織或正常組織傳代或轉(zhuǎn)化而來，可懸浮培養(yǎng)或采用載體培養(yǎng)，能大規(guī)模生產(chǎn)。這些細(xì)胞可無限傳代，但到一定代次后，致瘤性會(huì)增強(qiáng)。所以對(duì)生產(chǎn)用傳代細(xì)胞系應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格檢查。應(yīng)按本規(guī)程一、(三)細(xì)胞庫細(xì)胞的檢定的規(guī)定進(jìn)行細(xì)胞庫的檢查。對(duì)生產(chǎn)過程中細(xì)胞培養(yǎng)的要求如下： 1．用于生產(chǎn)的細(xì)胞代次用于生產(chǎn)的傳代細(xì)胞系，代次都有一定限制。用于生物制品生產(chǎn)的細(xì)胞最高限定代次，須經(jīng)批準(zhǔn)。 2．在生產(chǎn)末期進(jìn)行外源病毒因子檢測
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