【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 時(shí)間太短? 對(duì)策：純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量? 更換Buffer或調(diào)整濃度? 重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物? 降低退火溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間PCR常見(jiàn)問(wèn)題之二非特異性擴(kuò)增 現(xiàn)象：PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。原因：引物特異性差 模板或引物濃度過(guò)高 酶量過(guò)多 Mg2+濃度偏高 退火溫度偏低 循環(huán)次數(shù)過(guò)多對(duì)策：重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢式PCR 適當(dāng)降低模板或引物濃度 適當(dāng)減少酶量 降低鎂離子濃度 適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法 減少循環(huán)次數(shù) PCR常見(jiàn)問(wèn)題之三拖尾 現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài) 原因：模板不純 Buffer不合適 退火溫度偏低 酶量過(guò)多 dNTP、Mg2+濃度偏高循環(huán)次數(shù)過(guò)多對(duì)策：純化模板 更換Buffer 適當(dāng)提高退火溫度 適量用酶 適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度 減少循環(huán)次數(shù)PCR常見(jiàn)問(wèn)題之四假陽(yáng)性（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測(cè)基因表達(dá)情況)現(xiàn)象：空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物原因：靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染 對(duì)策：1 操作時(shí)防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；2 除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。離心管及槍頭等均一次性使用。3 各種試劑先進(jìn)行分裝，低溫貯存。四種策略巢式PCR（NestPCR）、遞減PCR（TouchDown PCR）、熱啟動(dòng)PCR（HotStart PCR）、使用PCR增強(qiáng)劑策略之一巢式PCR（NestPCR）? 巢式PCR的使用降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性，因?yàn)橥嗵滓锒蓟パa(bǔ)的靶序列很少。216。 巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的靈敏度，并且提高了困難PCR（如539。 RACE）的特異性。 策略之二遞減PCR（TouchDown PCR）? 遞減PCR通過(guò)在PCR的前幾個(gè)循環(huán)使用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饤l件提高特異性。循環(huán)設(shè)在比估算的Tm高大約5℃的退火溫度下開(kāi)始，然后每個(gè)循環(huán)降低12℃,直到退火溫度低于Tm 5℃。216。 特異性最高的目的模板會(huì)被優(yōu)先擴(kuò)增，這些產(chǎn)物在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增占據(jù)優(yōu)勢(shì)。216。 遞減PCR對(duì)于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更為有用，如AFLP、DNA指紋分析等。策略之三熱啟動(dòng)PCR （HotStart PCR）? 熱啟動(dòng)主要是通過(guò)抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR 儀達(dá)到變性溫度；? 現(xiàn)在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，該酶具有熱啟動(dòng)的性能，使用簡(jiǎn)單方便，適合于高通量應(yīng)用；? 熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。策略之四使用PCR增強(qiáng)劑? 甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜堿等都可充當(dāng)PCR的增強(qiáng)劑。? 其可能的機(jī)理是降低熔解溫度，從而有助于引物退火并輔助DNA聚合酶延伸通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)。216。 增強(qiáng)劑濃度要適當(dāng) 十、 PCR污染（一）污染原因1 模板間交叉污染2 PCR試劑污染3 實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染（二）防止污染的方法1 合理分隔實(shí)驗(yàn)室2 移液槍不能接觸PCR相關(guān)試劑3 手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用4 設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照，重復(fù)實(shí)驗(yàn)十一、 PCR技術(shù)的應(yīng)用? 1 基因組中特異片段克隆? 2 反向PCR? 3 不對(duì)稱PCR? 4 RTPCR? 5 基因的體外誘變? 6 基因組的比較研究核酸的分子雜交Nucleic Acid Hybridization核酸分子雜交： 把同源關(guān)系較近的，不同生物個(gè)體來(lái)源的變性DNA或RNA單鏈，經(jīng)退火處理形成DNADNA或DNARNA這一過(guò)程叫分子雜交。 或是指同一生物個(gè)體非同一分子來(lái)源但具有互補(bǔ)序列（或某一區(qū)段互補(bǔ)）的兩條多核苷酸鏈，通過(guò)堿基配對(duì)形成穩(wěn)定的雙鏈分子的過(guò)程。五、DNA芯片技術(shù)一、核酸分子雜交技術(shù)的原理 有互補(bǔ)特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混在一起時(shí)，其相應(yīng)同源區(qū)段將會(huì)退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。 如把一段已知基因（DNA或RNA）的核酸序列用合適的標(biāo)記物（如放射性同位素、生物素等）予以標(biāo)記，當(dāng)作探針（probe),在一定條件下， 按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與變性后的互補(bǔ)單鏈基因組DNA或RNA等進(jìn)行雜交（變性）形成雙鏈雜交體， 鑒定靶序列的存在、分子大小或進(jìn)行靶序列的相對(duì)定量分析。 用合適方法（如放射自顯影或免疫組織化學(xué)等技術(shù)）把標(biāo)記物檢測(cè)出來(lái)，就可確定靶核苷酸序列的拷貝數(shù)及表達(dá)豐度等。 應(yīng) 用：1）檢測(cè)特定生物有機(jī)體之間是否存在親緣關(guān)系；2）用來(lái)揭示核酸片段中某一特定基因的存在與否、拷貝數(shù)及表達(dá)豐度。 二、核酸探針的制備探針（Probe): 一段帶有檢測(cè)標(biāo)記的與目的基因或目的DNA特異互補(bǔ)的已知核苷酸序列。探針的制備方法探針長(zhǎng)度一般以50~300bp為宜。 制備方法：1）利用DNA重組技術(shù)2）PCR擴(kuò)增3）化學(xué)合成探針的分類： 據(jù)制備方法及核酸性質(zhì)不同，可分為：1 基因組DNA探針2 cDNA探針3 RNA探針4 寡核苷酸探針注意的問(wèn)題? 蛋白質(zhì)電泳? 常用SDSPAGE? 非變性PAGE? TrisTricine膠中電泳聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時(shí)要戴手套合成寡核苷酸探針注意原則：1）長(zhǎng)度（1050 bp)。 2) G:C對(duì)含量40%60%；3）探針內(nèi)避免互補(bǔ)；4）避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)；5）與非靶序列有70%以上同源性或連續(xù)8個(gè)以上堿基序列相同，最好不用。三、核酸探針的標(biāo)記為確定探針是否與相應(yīng)基因組DNA雜交，有必要對(duì)探針加以標(biāo)記，以便在結(jié)合部位獲得可識(shí)別的信號(hào)。標(biāo)記的種類同位素： 32P、35S、3H、125I等標(biāo)記探針?lè)峭凰兀?生物素、地高辛配體、熒光素等作為標(biāo)記物 兩者比較：后者不及前者敏感，但后者保存時(shí)間較長(zhǎng)，無(wú)同位素污染。一個(gè)理想的標(biāo)記物：1）標(biāo)記前后探針的基本結(jié)構(gòu)、化學(xué)性質(zhì)相同。2）特異性強(qiáng)、本底低、重復(fù)性好；3）操作簡(jiǎn)單、節(jié)時(shí)；4）安全、無(wú)環(huán)境污染。探針的標(biāo)記方法（1）缺口平移法（2）隨機(jī)引物標(biāo)記法（3）末端標(biāo)記法（4）生物素光照標(biāo)記法缺口平移法的原理將DNAase I 的水解活性與大腸桿菌DNA polymerase I 的5`→3`的聚合酶活性和5` →3`的外切酶活性相結(jié)合。首先用DNAase I 在探針DNA雙鏈上造成缺口， pol I的5`→3`外切酶活性，切去帶有5`磷酸的核苷酸；同時(shí)利用該酶5`→3`聚合酶活性，使生物素或同位素標(biāo)記的互補(bǔ)核苷酸補(bǔ)入缺口。 這兩種活性同時(shí)作用，缺口不斷向3`方向移動(dòng)，DNA鏈上的核苷酸不斷為標(biāo)記的核苷酸取代，成為帶有標(biāo)記的DNA，純化除去游離脫氧核苷酸后成為標(biāo)記DNA探針。 隨機(jī)引物標(biāo)記法原理 用一些六核苷酸作為隨機(jī)引物，將這些引物和探針DNA片段一起熱變性，退火后，引物與單鏈DNA互補(bǔ)結(jié)合，再在DNA聚合酶的作用下，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則不斷在其3` OH端添加標(biāo)記的單核苷酸修補(bǔ)缺口，合成新的標(biāo)記的探針片段。末端標(biāo)記法原理（1）一種是在5`末端加成標(biāo)記法： 先用堿性磷酸酶（AP）去掉dsDNA 5`磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化標(biāo)記的ATP轉(zhuǎn)移加到DNA片段5`OH上。（2）在探針3`末端用末端轉(zhuǎn)移酶摻入一個(gè)單標(biāo)記的ddUTP。生物素光照標(biāo)記法光敏生物素在紫外線照射下與DNA或RNA的堿基發(fā)生化學(xué)加成反應(yīng)，獲得生物素標(biāo)記的DNA探針。四、核酸分子雜交技術(shù)? 將特定的單鏈DNA或RNA混合在一起，其相應(yīng)的同源區(qū)段（互補(bǔ)）就會(huì)退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。如果退火的核酸來(lái)自不同的生物有機(jī)體，所形成的雙鏈分子就被稱為雜種核酸分子。能夠雜交形成雜種分子的不同來(lái)源的DNA分子，其親緣關(guān)系較為密切；反之，其親緣關(guān)系則比較疏遠(yuǎn)。因此，DNA/DNA的雜交作用，可以用來(lái)檢測(cè)特定生物有機(jī)體之間是否存在著親緣關(guān)系，而形成DNA/RNA間雜種分子的能力可被用來(lái)揭示核酸片段中某一特定基因的位置。? 在大多數(shù)核酸雜交反應(yīng)中，經(jīng)過(guò)凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，都必須通過(guò)毛細(xì)管或電導(dǎo)作用被轉(zhuǎn)移到濾膜上，而且是按其在凝膠中的位置原封不動(dòng)地吸印上去的，因此，核酸雜交也被稱為DNA印跡雜交。由于該方法是EMSouthern于1975年首先設(shè)計(jì)出來(lái)的，所以又叫做Southern blotting。雜交中常用的濾膜有尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜和二乙氨基乙基纖維素濾膜(DEAE)等。? 核酸分子雜交包括兩個(gè)步驟：第一，將樣品轉(zhuǎn)移到濾膜（印跡轉(zhuǎn)移）。第二，將濾膜與DNA或RNA探針進(jìn)行雜交。具體步驟：轉(zhuǎn)移。在80℃下烘烤1～2h或用紫外線交聯(lián)法將DNA片段永久性地固定在濾膜上。放入探針溶液中進(jìn)行核酸雜交。一旦與濾膜上的單鏈DNA雜交之后，就很難再解鏈。用漂洗法去掉沒(méi)有雜交上的探針?lè)肿印７派湫酝凰貥?biāo)記的探針可檢測(cè)2ng ；為了安全，我們用DIG（地高辛）標(biāo)記探針，熒光法檢測(cè)雜交信號(hào) 。? 基因組DNA被限制性內(nèi)切酶酶切為DNA片段；各片段經(jīng)電泳后在凝膠分為條帶；（c）中由下到上是：玻璃板、一層濾紙、凝膠、濾膜、很多層濾紙、玻璃板、重物。通過(guò)毛細(xì)管作用將凝膠上的DNA條帶原封不動(dòng)地吸印到濾膜上去。（d）在80℃下烘烤1～2h或用紫外線交聯(lián)法將DNA片段永久性地固定在濾膜上并形成單鏈。(e) 濾膜放入帶標(biāo)記的DNA或RNA核酸探針溶液中進(jìn)行核酸雜交。核苷酸序列分析? 儀器分析發(fā)展很快。? 如果將來(lái)做測(cè)序工作，有了分子生物學(xué)基礎(chǔ)，就可以做。? 如果將來(lái)工作中需要測(cè)序，一般送到公司去測(cè)。（一）Southern 印跡雜交此技術(shù)由Southern 1975年首先設(shè)計(jì)。被檢測(cè)對(duì)象為DNA。 （二）Northern印跡雜交與Southern雜交類似。檢測(cè)目的RNA的存在與否及含量。（三）Western印跡雜交 將待檢測(cè)蛋白質(zhì)（或酶）經(jīng)PAGE電泳并染色后，轉(zhuǎn)移到濾膜上固定，再用“抗體抗原”免疫反應(yīng)或“DNAprotein”結(jié)合反應(yīng)鑒別濾膜上的蛋白質(zhì)。（四）斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交適合于核酸樣品的定性檢測(cè)，而不是定量檢測(cè)。優(yōu)點(diǎn)簡(jiǎn)單、迅速；核酸粗提、多樣品檢測(cè)缺點(diǎn)不確定分子量、特異性不高，假陽(yáng)性 (五）原位雜交in situ hybridization 又分為菌落雜交或噬菌斑、以及真核細(xì)胞原位雜交。 標(biāo)記的核酸探針與組織切片或細(xì)胞中的待測(cè)核酸中的互補(bǔ)序列雜交。 1969, Pardue 爪蟾核糖體基因探針 1970, Orth 兔乳頭狀瘤病毒cDNA探針? 核酸原位雜交技術(shù)就是利用放射性或非放射性標(biāo)記的已知核酸探針，通過(guò)放射自顯影或非放射檢測(cè)系統(tǒng)在組織、細(xì)胞及染色體上檢測(cè)特異DNA或RNA序列的一種技術(shù)，是一種直接、簡(jiǎn)便的研究基因定位和表達(dá)的方法。 原位雜交的雜交雙方是待測(cè)核酸序列及探針，待測(cè)核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因組DNA和細(xì)胞總RNA。核酸探針是指用放射性同位素、非放射性熒光染料直接或間接標(biāo)記的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知DNA或RNA片段。根據(jù)其來(lái)源和性質(zhì)可分為cDNA探針、基因組DNA探針、寡核苷酸探針、RNA探針等。一、原位雜交的基本原理? 當(dāng)溶液中的DNA分子經(jīng)高溫或高PH處理后，DNA雙鏈分子會(huì)變性產(chǎn)生兩條單鏈，如果將溫度逐漸下降或PH恢復(fù)到中性，單鏈會(huì)按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，重新形成氫鍵恢復(fù)到原來(lái)的雙鏈結(jié)構(gòu)。如果兩條單鏈的來(lái)源不同，只要它們之間的堿基順序同源互補(bǔ)或者部分同源互補(bǔ)，在條件適宜時(shí)，就可以全部或部分復(fù)性，產(chǎn)生分子雜交。? 原位雜交技術(shù)包括有：菌落原位雜交（colony in situ hybridization）、斑點(diǎn)雜交法（Dot blot）、Southern印跡雜交（Southern blot）、Northern印跡雜交（Northern blot）、組織原位雜交（Tissue in situ hybridization）和基因組原位雜交（Genome in situ hybridization)? 原位雜交組織化學(xué)技術(shù)在生命科學(xué)的研究中可視為一項(xiàng)革命性的技術(shù)。它使它們的研究從器官、組織和細(xì)胞水平走向分子水平。為各個(gè)學(xué)科的研究帶來(lái)突破性的進(jìn)展。其中特別突出的是細(xì)胞或組織的基因表達(dá)、染色體分析、病毒診斷和發(fā)育生物學(xué)。 原位雜交技術(shù)主要步驟：? 材料處理及細(xì)胞樣品的固定；? 樣品的制備和預(yù)處理；? 探針的制備和預(yù)雜交；? 探針及樣品的變性；? 雜交溫育；? 檢測(cè)雜交信號(hào)，進(jìn)行結(jié)果分析。染色體制片技術(shù)發(fā)展 ? 染色體制片主要包括三類：一是中期染色體制片，二是粗線期染色體制片，然后是DNA纖維制片 。? 中期染色體具有良好的形態(tài)結(jié)構(gòu)，容易辨認(rèn)，分辨率低，僅能達(dá)到1~3Mb，可檢測(cè)到的DNA序列間長(zhǎng)度一般要求超過(guò)1Mb。? 粗線期的染色體的線性長(zhǎng)度約為中期染色體的5~30倍，分辨率可達(dá)100kb，可識(shí)別的DNA片段長(zhǎng)度大于100kb 。? DNA纖維制備技術(shù)所產(chǎn)生的染色體纖維的分辨率接近游離態(tài)DNA雙螺旋，實(shí)際實(shí)驗(yàn)中可以達(dá)到幾個(gè)kb。玻片的處理 ? 原位雜交程序繁雜而且周期長(zhǎng) ，DNA更需要在玻片上表現(xiàn)出強(qiáng)有力的粘附性。? 常用的粘附劑有鉻礬明膠液、多聚賴氨酸溶液 、Vectorband Reagent粘附劑 、Tricholosilane（分子式為SiCl3(CH2)6CH=CH2 ） 、3氨丙基三乙氧基硅烷 （3Aminopropyl triethoxysilane, APES ）探針制備技術(shù) ? 探針的制備主要采用缺刻平移法、隨