利用短片段同源替換技術(shù)進(jìn)行位點(diǎn)特異修復(fù)cho細(xì)胞(編輯修改稿)
2025-08-10 14:38 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 bp，處于EGFP基因的編碼序列中。除第58位氨基酸殘基密碼子的中心堿基（FG1：TGG，F(xiàn)A1：TAG）外，F(xiàn)G1和FA1的其余序列均相同。為了避免轉(zhuǎn)染時(shí)模板的干擾，%瓊脂糖凝膠電泳分離并切膠純化FG1和FA1（見圖3），再分別以純化后的FG1和FA1為模板，使用引物1U和2D，進(jìn)行高保真PCR反應(yīng)，大量制備FG1和FA1，并用Wizard174。 PCR Preps DNA Purification System（Promega）純化，最終溶于無(wú)菌超純水中。同理，分別以pEGFPC1和pEGFP()C1為模板，使用引物1U和1D（5’AGTTCACCTTGATGCCGTTC3’），進(jìn)行高保真PCR反應(yīng)，以同樣的方式可制備雙鏈DNA片段FG2及其對(duì)照片段FA2，純化（見圖3）后最終亦溶于無(wú)菌超純水中。FG2和FA2均為695 bp，處于EGFP基因的編碼序列中，除第58位氨基酸殘基密碼子的中心堿基（FG1：TGG，F(xiàn)A1：TAG）外，F(xiàn)G2和FA2的其余序列均相同。圖分離PCR反應(yīng)所得DNA短片段的電泳圖Lane1：FA1Lane2：FA2Lane3：Marker DL2000Lane4：FG2Lane5：FG1Lane6：pEGFP()C1我們利用LF2000（4 181。g/each 24well）分別將純化后的FGFAFG和FA2（2 181。g/each 24well）轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，熒光顯微鏡觀察，結(jié)果表明：?jiǎn)为?dú)轉(zhuǎn)染DNA片段FGFAFG2和FA2的CHO細(xì)胞均無(wú)綠色熒光。6. 靶向修復(fù)CHO細(xì)胞中游離的缺陷型EGPF基因我們按照表1，設(shè)計(jì)4個(gè)轉(zhuǎn)染組合，各自使用24well細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，將每個(gè)孔中的細(xì)胞對(duì)應(yīng)傳至單個(gè)35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，相當(dāng)于1：5傳代。表不同的小片段DNA與pEGFP()C1組合共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞加樣表組合12345共轉(zhuǎn)染的小片段DNA（3181。g/each 24well）FG1FA1FG2FA2空白對(duì)照共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA（ 181。g/each 24well）pEGFP()C1陽(yáng)離子脂質(zhì)體（4181。g/each 24well）Lipofectamine?2000（LF2000）按照表1加樣轉(zhuǎn)染后48小時(shí)用熒光顯微鏡觀察，我們?cè)诮M合1和組合3中發(fā)現(xiàn)綠色熒光的CHO細(xì)胞，而在對(duì)照實(shí)驗(yàn)組合組合4和組合5中的細(xì)胞均無(wú)綠色熒光（見彩版I：圖2～圖6）。 FACS分析轉(zhuǎn)染結(jié)果我們依然按照表1中的轉(zhuǎn)染組合使用24well細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每個(gè)組合平行做三組實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)將三組細(xì)胞用于FACS，分析50000個(gè)CHO細(xì)胞，計(jì)算綠色熒光細(xì)胞的百分比例，結(jié)果如圖7所示。FACS分析表明：％的細(xì)胞具有綠色熒光，％的細(xì)胞具有綠色熒光，組合組合4和組合5中的細(xì)胞均無(wú)綠色熒光。圖各組合轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞的FACS分析結(jié)果（平行三組實(shí)驗(yàn)）短片段同源替換技術(shù)是近年來(lái)在同源重組的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的基因打靶技術(shù)。與傳統(tǒng)的基于同源重組的基因打靶技術(shù)相比，短片段同源替換技術(shù)能夠?qū)⒋虬行侍岣?000～10000倍。目前，只有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室從事短片段同源替換技術(shù)的研究，并且研究對(duì)象僅僅局限于囊腫性纖維化和杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良遺傳疾病的細(xì)胞系和動(dòng)物模型。我們?cè)噲D將短片段同源替換技術(shù)應(yīng)用于更加廣泛的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系以及小鼠胚胎干細(xì)胞系。作為初步研究工作，選擇打靶CHO細(xì)胞中游離的缺陷型EGFP基因的策略，使得極少數(shù)的CHO細(xì)胞在恢復(fù)綠色熒光表型后能夠很容易在熒光顯微鏡下被觀察到。由于這一策略的靈敏性，％％的經(jīng)FG1和FG2小片段修復(fù)的細(xì)胞。為了確認(rèn)我們所引進(jìn)的EGFP基因無(wú)義點(diǎn)突變（TAG）能夠終止正常綠色熒光蛋白的表達(dá)，我們用攜帶缺陷型EGFP基因的質(zhì)粒pEGFP()C1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察沒有發(fā)現(xiàn)綠色細(xì)胞。這就表明無(wú)義突變的引入成功地終止了綠色熒光蛋白的表達(dá)，因此實(shí)驗(yàn)中pEGFP()C1分別和DNA片段FGFG2共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后，熒光顯微鏡觀察到的綠色細(xì)胞并非pEGFP()C1滲漏表達(dá)的結(jié)果，而是DNA短片段同源替換引起的基因修正。起初短片段同源替換的研究通常使用變性后的PCR產(chǎn)物，即ssDNA片段，后來(lái)的研究表明dsDNA片段具有ssDNA片段同樣的效果，本文中我們使用的是dsDNA片段。在制備短片段DNA FGFG2 以及對(duì)照片斷FA1和FA2的時(shí)候，我們?yōu)榱朔乐筆CR產(chǎn)物中存在的微量模板DNA可能對(duì)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)帶來(lái)干擾，所用的片段均經(jīng)電泳分離純化后，再次PCR擴(kuò)增和分離純化（見正文“”部分）。將上述片段分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后均沒有發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白的表達(dá)，說明上述片段均不能單獨(dú)引起綠色熒光蛋白的表達(dá)。另外，在按照表1的4個(gè)組合共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后，我們僅在共轉(zhuǎn)染FG1/pEGFP()C1和FG2/pEGFP()C1的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有綠色熒光蛋白表達(dá)。而本實(shí)驗(yàn)室有人曾經(jīng)將pEGFP()C1與紅色熒光蛋白（DsRed1）基因的DNA短片斷共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，沒有觀察到任何細(xì)胞恢復(fù)綠色熒光。這說明短片段同源替換介導(dǎo)的基因修復(fù)具有序列特異性。％％。由于并非所有的細(xì)胞都同時(shí)轉(zhuǎn)入了片段和質(zhì)粒，我們必須校正轉(zhuǎn)染效率才能夠換算出基因修復(fù)效率。我們共轉(zhuǎn)染等量的pEGFPC1和片段FR，估計(jì)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率約為10～20％。％～1％，此結(jié)果與國(guó)際上其他研究組獲得的結(jié)果相當(dāng)。短片段DNA的穩(wěn)定性是本實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵之一。由于DNA片段沒有進(jìn)行任何修飾，進(jìn)入細(xì)胞中的短片段DNA可能會(huì)被細(xì)胞中核酸酶降解而不能起到修復(fù)基因的作用。但是，參考本實(shí)驗(yàn)室其他研究人員的工作成果，在CHO細(xì)胞中單獨(dú)轉(zhuǎn)染短片段DNA 72小時(shí)后，仍然可以檢測(cè)出完整存在的短片段；說明進(jìn)入CHO細(xì)胞中的短片段DNA，降解較慢。我們考慮到脂質(zhì)體的包裹可能對(duì)短片段的穩(wěn)定性起到一定
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