【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 α2b只有極輕微的降解。Ayed等添加酪蛋白水解物并維持在0. 1%或EDTA 并維持在10mmol /L后,均能阻止h IFNα2b 的降解,前者使產(chǎn)物保持恒定,后者使表達(dá)量提高65%?！　H對(duì)菌體生長(zhǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)都會(huì)產(chǎn)生影響,尤其是誘導(dǎo)時(shí)的pH,不僅會(huì)影響蛋白表達(dá)量和活性,而且會(huì)通過(guò)影響蛋白酶活性,來(lái)改變蛋白的降解程度。如當(dāng)pH由3升至7時(shí), rHSA的降解逐漸減少。因此,必須選擇合適的pH,一般在3. 0～7. 0,而且在不同階段,應(yīng)選擇不同pH,采用變pH發(fā)酵。pH一般是通過(guò)補(bǔ)加氨水來(lái)調(diào)節(jié),若NH4+濃度過(guò)高,則改為補(bǔ)加堿來(lái)調(diào)節(jié)?！　? 溫度升高,有利于生長(zhǎng)代謝和蛋白表達(dá),但溫度過(guò)高反而會(huì)使菌體過(guò)早衰老,發(fā)酵周期縮短,降低蛋白表達(dá)量和活性。因此,必須選擇合適的溫度,而且在不同階段,應(yīng)選擇不同的溫度,采用變溫發(fā)酵。菌體生長(zhǎng)最適溫度為30℃,誘導(dǎo)表達(dá)的最適溫度應(yīng)降低,常為2028℃,尤其是分泌蛋白,低溫更有利于表達(dá)。低溫可以降低折疊壓力,有利于新生肽鏈的正確折疊。降低菌體死亡率,減少蛋白酶分泌,降低蛋白酶活性。提高AOX酶活性和轉(zhuǎn)錄水平,還可以提高蛋白穩(wěn)定性。(DO )的影響　　高密度發(fā)酵需要消耗大量的氧氣,尤其是在甲醇誘導(dǎo)階段,供氧往往成為限制性因子。若供氧不足,不僅會(huì)抑制菌體呼吸作用,限制菌體生長(zhǎng)繁殖,而且會(huì)積累甲醇及其代謝產(chǎn)物甲醛和過(guò)氧化氫,對(duì)菌體產(chǎn)生毒害,降低蛋白表達(dá)量。因此,必須保證足夠的供氧,一般DO≥20% ～30% , DO也不能太高,超過(guò)60% ,細(xì)胞就會(huì)發(fā)生氧中毒。( CWPT I )與比生長(zhǎng)速率(μPT I )的影響CWPTI和μPTI分別反映菌體生物量和生理狀態(tài),提高CWPTI和μPTI均能有效提高蛋白表達(dá)量。提高CWPTI可以提高誘導(dǎo)階段的生物量,并使更多的甲醇轉(zhuǎn)向蛋白合成，,從而提高表達(dá)量。提高μPTI可以增強(qiáng)菌體翻譯效率,轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)時(shí),可迅速合成酶系代謝甲醇,快速表達(dá)出蛋白, 提高比生產(chǎn)速率和表達(dá)量。 第三章 木聚糖酶發(fā)酵的工藝流程運(yùn)用RT－PCR 從黑曲霉AN070902 中克隆木聚糖酶cDNA 片段，與載體pPIC9K 相連，構(gòu)建重組載體VMAN－pPIC9K，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，篩選產(chǎn)酶最高菌株進(jìn)行液體發(fā)酵。在該項(xiàng)設(shè)計(jì)中，高效產(chǎn)酶菌株由工廠準(zhǔn)備并儲(chǔ)存。 的獲得－pPIC9K 的構(gòu)建－pPIC9K－GS115 將可以分泌木聚糖酶的重組畢赤酵母加入到大型種子罐中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，種子罐操作。(1)溫度控制：30177。1℃。(2)(NH4)2S04：添加量：5Kg/m3。(3)罐壓：。(4)通風(fēng)控制：O～6h，36～40m3/h；7～11h，漸增至72m3/h；12～15h，漸增至144m3/h；16～19h，180m3/h；20～24h，280～288m3/h：24h后，360m3/h；加大風(fēng)量，可使菌體生長(zhǎng)速率加快，但菌體呼吸強(qiáng)度和雜菌生成量可能增加。(5)培養(yǎng)時(shí)間：36h。本設(shè)計(jì)一級(jí)種子罐培養(yǎng)時(shí)間為20h，二級(jí)種子罐培養(yǎng)時(shí)間為16小時(shí)。(6)攪拌速率：220r/min（1）原料的選擇選來(lái)源豐富、質(zhì)量好、且便于儲(chǔ)存運(yùn)輸?shù)脑?；因地制宜，就近取材，盡量降低成本；符合生產(chǎn)工藝要求；（2）菌種:根據(jù)實(shí)際需要，本次設(shè)計(jì)用到的重組巴斯德畢赤酵母基因工程菌由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建（如上所述）并保藏。（3）培養(yǎng)基及所需溶液: YPDs/Zeoein:1og/L酵母膏、Zog/L蛋白陳、209/L葡萄糖、log/L瓊脂、100mg/LZeoein。YPD:10歲L酵母膏、20留L蛋白陳，20留L葡萄糖、10留L瓊脂。BMGY:1og/L酵母膏、Zog/L蛋白陳、20g/L葡萄糖、Zog/L瓊脂、 ，pH=， ，4xl04g/L生物素、20g/L甘油、L一eys?；A(chǔ)鹽溶液(FM21):CaS042H20 。 KOH 。 MgS047Hz0 。 K2S04 。 H3P04 85% %(v/v)。微量元素溶液(PTM1):ZnC12 2。 FeS047H20 。 H3B03 。MnSO4H20 。H2S04 96% % (v/v)。CuS045H2O 。 KI 。biotin 80 ug l1。種子培養(yǎng)基:甘油10。 peptone 20。 yeast extract 10。 KH2P04 。 Na2HP04 。(NH4)S04 1。MgS047H20 1。FeS047Hz0 。甘油期間歇發(fā)酵培養(yǎng)基:甘油40。 biotin 80 ug l1。 H3P04 85% 2% (v/v)和定量的FM21和PTM 1。甘油期流加發(fā)酵培養(yǎng)基:50% (V/V)的甘油配以一定量的FM21和TM l 。甲醇期流加發(fā)酵培養(yǎng)基:100%的甲醇配以一定量的FM21和PTM l 。蛋白陳、酵母膏購(gòu)自O(shè)XOID公司。其它試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭＞w在種子罐中培養(yǎng)后，然后以10%的接種量進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，發(fā)酵罐的總體積為60m3，工作體積為48m3。發(fā)酵過(guò)程采用了Invitrogen Corporation的發(fā)酵規(guī)范（Carlsbad, CA, USA, 2002），整個(gè)發(fā)酵過(guò)程分為甘油期和甲醇期兩個(gè)階段。甘油期以甘油為唯一碳源，目的是細(xì)胞高密度培養(yǎng)，發(fā)酵溫度為30℃；甲醇期以甲醇為唯一碳源，以生成目標(biāo)蛋白為目的。甘油期又分為甘油間歇期(1620 h)和甘油流加期(1418 h)，甲醇期分為甲醇誘導(dǎo)期(510 h)和產(chǎn)物生成期(140160 h)。發(fā)酵全程通過(guò)調(diào)節(jié)攪拌速率使溶氧濃度維持在30%左右，溶氧電極為INPRO6100/120/T/N（MettlerToledo, Switzerland）；通過(guò)流加氨水控制pH≈，pH電極為405DPASSCK8S/120（MettlerToledo, Switzerland）。甘油、甲醇和氨水的流加均使用校正好的蠕動(dòng)泵（Watson 101）進(jìn)行流加。無(wú)菌空氣的制備：利用溶解于溶液中的氧，其來(lái)源則是通過(guò)壓縮機(jī)提供的壓縮空氣。自然界的空氣是帶塵和細(xì)菌的空氣，且通過(guò)壓縮機(jī)壓縮和管道輸送，增加了水、油污、金屬屑等雜物，因此進(jìn)入發(fā)酵罐的空氣，必須是通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ㄌ幚砗蟮母蓛?、無(wú)菌空氣。滅菌工序技術(shù)工藝條件：(1)種子罐:空罐 120℃，30min；(2)發(fā)酵罐：空罐 120℃，30min；(3)接種管道、料管：～,120℃,20min。(4)總空氣管道：120～150℃，～,1h,每月一次。(5)無(wú)菌室：每周甲醛消毒一次，每天藥物消毒一次，每次使用前用紫外燈消毒20min。(6)注意隨時(shí)用漂白粉或其他藥物維持環(huán)境不污染。發(fā)酵罐操作：(1)溫度：30177。1℃。(2)接種量：1:10(每10m3發(fā)酵罐對(duì)應(yīng)1m3種子罐)。(3)罐壓：(表壓)。(4)風(fēng)量控制：0～18h，；18～30h，；30h。(5)攪拌轉(zhuǎn)速：220r/min(6)pH控制：37。(7)容氧：30%以上(8)發(fā)酵周期：50h， 比現(xiàn)有周期短80小時(shí)。(9)發(fā)酵過(guò)程控制：每 12 h 補(bǔ)加一次甲醇，碳源：％的甲醇混合 ％的甘油，氮源：常以氨水做氮源，發(fā)酵后期添加5％(NH4 ) 2 SO4 ,使NH4+濃度維持在150mmol/L以上(2 g/ L 左右)， 補(bǔ)料：流加50%的甘油、PTM鹽、液氨等，過(guò)程中細(xì)胞濃度達(dá)到220250 g/L。底物流加方法：在誘導(dǎo)初始階段, 細(xì)胞處于由甘油代謝向甲醇代謝的過(guò)渡適應(yīng)期, 甲醇比消耗速率不斷增加。當(dāng)細(xì)胞完全適應(yīng)甲醇環(huán)境后, 處于非生長(zhǎng)狀態(tài)下的畢赤酵母甲醇比消耗速率維持恒定。在這個(gè)階段, 底物的流加策略主要有直接添加甲醇及流加甘油和甲醇混合物兩種方式。大量的研究表明, 流加甘油和甲醇混合物更有利于外源蛋白的高效表達(dá)。事實(shí)上, 高密度補(bǔ)料? 批式發(fā)酵過(guò)程中, 在誘導(dǎo)初期, 流加甘油和甲醇的混合底物而不單獨(dú)流加甲醇的話, 菌體就不會(huì)由于甲醇的積累而中毒。此外, K atakura等研究表明, 在畢赤酵母高密度補(bǔ)料 批式發(fā)酵過(guò)程中, 在過(guò)渡階段流加甘油/甲醇混合底物有助于菌體更快地進(jìn)行甲醇代謝 。因此, 使用甘油和甲醇的混合底物比只使用甲醇作為唯一碳源的底物能更快地誘導(dǎo)醇氧化酶和更快地適應(yīng)細(xì)胞的代謝活動(dòng)。因?yàn)楦视屯ㄟ^(guò)提供能量和甲醇代謝酶類(lèi)所需的構(gòu)件有助于甲醇代謝酶類(lèi)的表達(dá), 從而避免甲醇對(duì)菌體的毒害作用。甲醇傳感器在線檢測(cè)控制甲醇的流加： 通過(guò)在線檢測(cè)甲醇濃度控制甲醇的流加, 由于傳感器靈敏度高, 響應(yīng)時(shí)間短, 因此能有效地控制甲醇的流加速率, 使甲醇的濃度維持恒定, 同時(shí)有效地解決甲醇抑制時(shí)實(shí)現(xiàn)恒化培養(yǎng)問(wèn)題, 是目前為止最好的一種檢測(cè)甲醇濃度的方法。 離心沉降設(shè)備有瓶式離心機(jī)、管式離心機(jī)、多室式離心機(jī)和碟片式離心機(jī)。用于分離生物化學(xué)產(chǎn)品的離心機(jī)通常為碟片式離心機(jī)。本設(shè)計(jì)采用噴嘴排渣的碟片式離心機(jī)，具有堅(jiān)硬的外殼，底部突出，與外殼鑄在一起，殼上由圓錐形蓋，由螺母緊固在外殼上，殼由高速旋轉(zhuǎn)的倒錐形轉(zhuǎn)鼓帶動(dòng)，其內(nèi)設(shè)有數(shù)十片錐角為60~120176。的錐形碟片,可進(jìn)行連續(xù)離心。 ，~。在轉(zhuǎn)鼓直徑最大處，~，一般為2~24個(gè)，由于排渣的含液量較高，具有流動(dòng)性，故噴嘴排渣的碟片式離心機(jī)可進(jìn)行發(fā)酵液的濃縮。轉(zhuǎn)鼓直徑可達(dá)900mm，最大處理量為300m179。/h。 根據(jù)現(xiàn)有型號(hào)，選用JMDJ211VC03C離心機(jī)，處理量為10~15t/h，分離因數(shù)9000，動(dòng)力22KW。 按照熱能傳遞給濕物料的方式，干燥方法可分為直接干燥，間接干燥和介電加熱干燥。對(duì)于一般的發(fā)酵車(chē)間采用的是直接干燥的方式，本設(shè)計(jì)采用的是噴霧干燥器發(fā)酵液干燥為固體顆粒。通過(guò)利用噴霧器將發(fā)酵液噴成霧狀，形成具有較大表面積的分散微粒同熱空氣發(fā)生強(qiáng)烈的熱交換，迅速排除本身的水分，在短時(shí)間內(nèi)獲得干燥。 將料液分散為霧滴的霧化器是噴霧干燥器的關(guān)鍵部件，常用的三種霧化器是氣流式霧化器、壓力式霧化器和旋轉(zhuǎn)式霧化器。本設(shè)計(jì)中發(fā)酵液屬于一般溶液，壓力為低壓，產(chǎn)品為微細(xì)固體，應(yīng)采用旋轉(zhuǎn)式霧化器。 干燥介質(zhì)在整個(gè)系統(tǒng)中只使用一次就排入大氣中，不在循環(huán)使用。 由于所生產(chǎn)的酶為熱敏性物質(zhì)，應(yīng)經(jīng)量降低發(fā)酵液的溫度，采用并流式使得最熱的熱風(fēng)與濕含量最大的霧滴接觸，因而濕份迅速蒸發(fā)，霧滴表面溫度接近空氣的濕球溫度，同時(shí)熱空氣濕度也顯著降低，因此從霧滴到干燥成品的整個(gè)歷程中，物料的溫度不高，這對(duì)于熱敏性的酶的干燥特別有利。菌種一級(jí)種子罐放大培養(yǎng)二級(jí)種子罐放大培養(yǎng)發(fā)酵罐發(fā)酵發(fā)酵液清洗廢水清洗廢水清洗廢水處理后進(jìn)污水池蒸汽、空氣、水、酵母粉、蛋白胨、甲醇、液氨等原料儲(chǔ)罐噴霧干燥塔熱空氣篩分分級(jí)半成品固體產(chǎn)品離心搖瓶培養(yǎng)圖31 木聚糖酶酶簡(jiǎn)易生產(chǎn)工藝流程圖表32 產(chǎn)品的規(guī)格與使用方法產(chǎn)品規(guī)格酶活（U/g）使用方法液體80000可單獨(dú)使用，實(shí)際生產(chǎn)中，請(qǐng)根據(jù)飼料配方在每噸配合飼料中添加酶活5000U/g的本品50g；與其他酶制劑配合使用，效果更加明顯。固體15000025kg復(fù)合袋包裝，原包裝、25℃以下、密封條件下可保存12個(gè)月，儲(chǔ)存中應(yīng)避免日曬、雨淋、高溫、高濕。而一般液體產(chǎn)品保存是在40℃% 。 木聚糖是植物性飼料原料中分布最廣、含量最高的一類(lèi)半纖維素，是飼料中非淀粉多糖的一種，普遍存在于植物飼料中，但以粕類(lèi)，特別是豆粕中含量較高（表32）；一些非常規(guī)粕類(lèi)，如棕櫚粕、椰子粕中含量更高，達(dá)25%35%。具體如下：表32 常用飼料原料中木聚糖含量飼料原料木聚糖含量飼料原料木聚糖含量（%）豆粕（44%）去皮豆粕（44%）棕櫚粕菜籽粕椰子粕2535棉粕葵花粕花生粕高粱小麥米糠芝麻粕34第四章 工藝計(jì)算設(shè)計(jì)任務(wù)：年產(chǎn)6000噸木聚糖酶發(fā)酵車(chē)間的設(shè)計(jì)工藝確定的工藝參數(shù)：菌種培養(yǎng)時(shí)間36h，種子培養(yǎng)溫度30176。C，發(fā)酵罐發(fā)酵時(shí)間50h，發(fā)酵罐操作周期為96小時(shí)，發(fā)酵溫度28176。C。重組畢赤酵母可獲得的發(fā)酵水平為50000U/mL、經(jīng)后處理得到的木聚糖酶活性為50000U/g、木聚糖酶的收率按80%，年工作日為280天。年產(chǎn)6000噸固體木聚糖酶的收率按80%計(jì)算，則一年所需發(fā)酵液中酶活為50000U/g木聚糖酶為6000/=7500t則一年需要發(fā)酵液為7500106 50000/50000=7500m3若工廠生產(chǎn)周期為4天，這有65個(gè)周期每周期需生產(chǎn)的發(fā)酵液：7500/65＝ m3確定采用總?cè)莘e為80 m3發(fā)酵罐，則需要發(fā)酵罐的個(gè)數(shù)為3個(gè)，填充系數(shù)72％。單罐批料量為： 8072%＝61t根據(jù)發(fā)酵液的接種量為1/10，所以投料量為:發(fā)酵罐61t，種子罐的個(gè)數(shù)為：每個(gè)發(fā)酵周期種子罐可生產(chǎn)次數(shù)為54247。36＝，取正數(shù)為1，則種子罐個(gè)數(shù)為2247。1＝2，設(shè)計(jì)種子罐2個(gè)?？紤]到工程菌損失1%，則年需發(fā)酵液為：61265（1+1%）= 實(shí)際年生產(chǎn)木聚糖酶的量為：80%=富裕量為：=富裕率為：100%=% ：換熱面積的計(jì)算基礎(chǔ)數(shù)據(jù)：6000 KJ/(m3h)。種子罐：采用立式蛇管換熱器，換熱系數(shù)為K＝400KJ/(m3h℃)冷卻水的入口溫度為9℃，出口溫度為17℃，種子罐溫度控制在30℃。平均溫度差：△tm=[(3017)(3017)]/{ln[(3017)/(309)]}=℃一級(jí)種子罐換熱面積：F=Q/（KΔtm）=[6000103/]/( 400)= m2二級(jí)種子罐換熱面積：F=Q/（KΔtm）=[6000103/]/