【文章內(nèi)容簡介】 g/ml 精液密度在 和 g/ml 之間 (Huggins 等 , 1942。 Brazil 等 , 2020a。 Cooper 等 , 2020))。 注： 空樣本容器可能具有不同的重量，所以每一容器必須提前分別稱重。用不退色標(biāo)記筆在容器上標(biāo)明或粘貼標(biāo)簽標(biāo)識 其重量。如粘貼標(biāo)簽標(biāo)識其重量，應(yīng)在稱重前即粘貼標(biāo)簽。 此外，可以直接測量精液體積 。 將精液直接射入廣口帶有刻度的錐形底量筒中，器材均可從市場上購得。 從量筒上直接讀取數(shù)值（精確到 ml）。 注： 不推薦用移液器或是注射器從標(biāo)本容器中吸取樣本然后注入量筒中測量體積，因該方式無法保證不損失樣本，而這會導(dǎo)致對體積的低估。該法導(dǎo)致的體積損失量在 （ Brazil 等， 2020a； Iwamoto等， 2020； Cooper 等 , 2020）。 注釋 1： 低精液體積是生殖道梗阻或先天性雙側(cè)輸精管缺 如（ CBAVD） (de la Taille 等 , 1998。 Weiske 等 , 2020。 Daudin等 , 2020。 von Eckardstein 等 , 2020)的特征。 同時也可能是精囊發(fā)育不良的一個表現(xiàn) 。 注釋 2： 低精液體積也可能是在精液收集過程中產(chǎn)生了問題（如損失了部分精液），也可能為部分逆行射精或有男科缺陷。 注釋 3： 高精液體積可以反映附屬性腺分泌旺盛，可能存在活動炎癥的情況。 參考值下限 精液體積的參考值下限為 ml（ 95%置信區(qū)間（ CI）， ）。 精液 pH值 精液 pH值主要反映出由精囊腺分泌的堿性液體和由前列腺分泌的酸性液體之間的平衡情況。應(yīng)在精液液化 30分鐘后進行，無論如何不要超過 1個小時，以免因 CO2 丟失而影響檢測結(jié)果，正常情況下選用范圍在 。 均勻攪拌樣本 (見框 )。 將一滴精液在 pH試紙上均勻展開。 等待浸濕區(qū)域的顏色均勻一致（等候時間＜ 30秒）。 與標(biāo)準(zhǔn)帶比色讀出其 pH值。 注： pH試紙的準(zhǔn)確性應(yīng)該按照已知標(biāo)準(zhǔn)進行檢測。對于粘稠的樣本，可取小份樣本用專為測量粘稠溶液設(shè)計的 pH量尺進行檢測。 (Haugen 和 Grotmol, 1998)。 參考值 對于生育男性精液 pH值 的參考值 尚 未 確定，現(xiàn)保持原有下限值 。 注釋 1： 如低體積低精子數(shù)目的精液樣本的 pH低于 ，可能存在生殖道梗阻 或先天性雙側(cè)輸精管缺如（ CBAVD） (de la Taille 等 , 1998。 Weiske 等 , 2020。 Daudin等 , 2020。 von Eckardstein 等 , 2020)。 同時也可能是精囊發(fā)育不良的一個表現(xiàn) 。 注釋 2： 精液的 pH值 如 隨時間推移而升高，可能是由于自然緩沖物減少，所以高pH值不能提供有價值的臨床信息。 顯微鏡初檢 建議使用相差顯微鏡對所有未染色的新鮮精液標(biāo)本進行檢查，初檢的總放大倍數(shù)為 100 倍（即物鏡 10179。和目鏡 10179。），對標(biāo)本進行一般觀察包括： 粘液絲； 精子凝集； 非精子細胞包括：上皮細胞、圓形細胞（白細胞和未成熟精子細胞）及斷裂的精子頭部或尾部，這應(yīng)在總放大倍數(shù)為 200或 400倍的條件下進行； 評估精子活力 (見 )； 根據(jù)精子計數(shù)要求決定稀釋倍數(shù) (見 )。 充分混勻精液和取樣 充分均勻液化的精液本身就有利于解決化驗取樣是誤差的問題，如樣 本不夠均勻，觀察同一份精液制備兩份標(biāo)本有關(guān)精子活動、活力、密度及形態(tài)等結(jié)果時可能出現(xiàn)明顯偏差，為了給生育力的評估提供可靠資料，在檢測前，精液樣本必須充分混勻 (見框 )，兩等份的數(shù)值必須相符才可接受測量結(jié)果。兩份標(biāo)本經(jīng)泊松分類的精子數(shù)目（見框 ，表 ）和其百分率的二項分布（見框 ，表 ）需要一致。 框 充分混勻精液： 在取微量樣本進行檢測前，樣本必須在容器內(nèi)充分混勻，力度要輕柔以免氣泡產(chǎn)生，可通過向樣本中插入一個寬孔（直徑接近 ）的一次性無菌塑料吸液 管抽吸 10次來達到混勻標(biāo)本的目的。不可用高速渦旋器，以免對精子造成損傷。 濕片的制作 充分混勻精液樣本（見框 )； 混勻后立即取樣，以免精子在懸液中沉淀； 再次取樣前還需進行混勻，進行分析檢查時精液體積和蓋玻片的尺寸必須標(biāo)準(zhǔn)化，以保持精子在固定厚度約 20181。m條件下自由游動將 10181。l 的定量精液滴在干凈載玻片上； 蓋上 22mm179。 22mm的蓋玻片，形成近 20181。m厚度，蓋玻片的重量使標(biāo)本均勻展開； 應(yīng)注意避免在蓋玻片和載玻片之間產(chǎn)生氣泡； 對新制成的濕片，等到玻片上界面不再晃動時應(yīng)盡快進行檢測。 框 濕片的厚度： 涂片的厚度（ D181。m）是樣本的體積（ V， 181。l =mm3）除以它的液面寬度（ A，mm2）： D=V/A。如，體積為 10181。l 的精液置于一張潔凈的載玻片上，加蓋面積為22mm179。 22mm的蓋玻片（面積為 484 mm2），則其厚度應(yīng)為 ；若體積為 的樣本上加蓋一張 18mm179。 18mm的蓋玻片（面積為 324 mm2），則其厚度為；如體積為 11181。l 的樣本上加蓋一張 21mm179。 26mm的蓋玻片（面積為 546 mm2），則其厚度為 ；偶爾會出現(xiàn)大厚度的情況，如 40181。l 的樣 本上加蓋一張 24mm179。 50mm的蓋玻片（面積為 1200 mm2），則其厚度為 ； 注 1： 涂片的深度小于 20181。m會限制精子的旋轉(zhuǎn)運動 (Le Lannou 等 , 1992。 Kraemer 等 , 1998) 注 2： 如厚度過大 ， 則會因為精子在視野中來回運動而難以進行精子評估。 注 3： 如每一視野中精子的數(shù)目差異過大，則樣本可能是不具有代表性的。如出現(xiàn)此種情況則應(yīng)重新充分混勻精液標(biāo)本（見框 ）并按照上述步驟重新制備一張涂片。 注 4： 欠缺代表性也可能會導(dǎo)致粘稠度和液化的異常（見 ），精子的聚集（見 ）或精子的凝集（見 ）。 精子聚集 不活動精子之間、活動精子與粘液絲之間、非精子細胞成分或細胞碎片等粘在一起，為非特異性聚集（圖 ），這種情況應(yīng)如實記錄。 圖 精液中精子的非特異性聚集 圖示為精子與上皮細胞（ a），細胞殘渣（ b）及精子（ c， d）的聚集現(xiàn)象。 顯微圖像由 C Brazil提供 精子凝集 精子凝集是指活動精子以不同方式，頭對頭、尾對尾或混合型，如頭對尾，彼此粘在一起。 劇烈震蕩會使精子活力過度表現(xiàn)，但有時由于凝集會限制精子的活動力。任何 精子的頭部，尾部或中段有粘附現(xiàn)象都應(yīng)如實記錄。凝集的類型（反應(yīng)其程度（ 14級））和吸附狀態(tài)（ AE級）也應(yīng)記錄（ Rose 等 , 1976）（見圖 ）。 一級：輕度聚集指每個凝塊中少于 10條精子； 二級：中度聚集指每個凝塊有 10到 50條精子，精子運動自如； 三級：大片聚集指 每個凝塊有多余 50條精子，精子仍然運動自由； 四級：整個精子聚集，所有精子聚集在一起彼此相互連接。又可分根據(jù)程度又可分 a b c d。 注： 運動的精子粘附于細胞，細胞碎片或是非運動的精子（聚集）應(yīng)該記為凝集。 圖 表 涉及部分 聚集等級 完全分離 聚集精子數(shù)＜ 10個， 多數(shù)精子為游離狀態(tài) 中等聚集 聚集精子數(shù) 10~50個， 有游離精子 高度聚集 聚集精子數(shù)＞ 50個， 部分精子游離 完全聚集 所有精子均聚集一團，無游離精子 1． 輕度聚集指每個凝塊中 少于 10條精子； 2． 中度聚集指每個凝塊有 10到 50條精子，精子運動自由； 3． 大片聚集指 每個凝塊有多余 50條精子，精子仍然運動自由； 4． 整個精子聚集，所有精子聚集在一起彼此相互連接。 A． 頭對頭 B． 尾對尾 C． 尾端對尾端 D． 混合型 E． 糾結(jié)型 注釋 1： 存在凝集并不能充分證實為不育的免疫性原因，但是能夠說明有抗精子抗體的存在；還需進一步檢查以明確診斷（見 ）。 注釋 2： 嚴(yán)重的精子凝集能夠影響對精子活力和密度的評估。 其他非精子細胞成分 精液中常含 有一定的非精子細胞成分，部分與臨床關(guān)系密切。通常包括泌尿生殖道 上皮細胞、前列腺細胞、生精細胞和白細胞，后兩種統(tǒng)稱為“圓細胞” (Johanisson 等 , 2020)。這些細胞成分在染色后的涂片中（放大 1000 倍）難以區(qū)別 (見 節(jié) , 表 13 和 14,以及 節(jié) )?？梢酝ㄟ^過氧化物酶技術(shù)和全白細胞單克隆抗原技術(shù)來進行鑒別。非精子細胞成分計數(shù)用與精子相同的方法進行，或根據(jù)染片 (見 節(jié) )中生精細胞或白細胞與精子的比例來進行計算。 （山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖中心 董乾 江蘇無錫婦幼保健院生殖中心 王洪華） 精子活力分析 精子活力程度與妊娠率有關(guān)，電腦輔助法評估精子的運動性見第 節(jié)。精子活力評估應(yīng)在精液樣本液化后盡快（最好在 30 分鐘之內(nèi)）進行，務(wù)必在射精后 1 個小時之內(nèi)進行。防止時間過長，因脫水、 pH 值及溫度的變化對評估結(jié)果 產(chǎn)生的負(fù)面影響。 過程如下： 178。 將精液樣本混勻。 178。 拌勻后立即（防止精子沉淀）取出一等份。 178。 重新攪拌精液樣本的剩下部分，取出另一等份。 178。 將上面的兩份樣本分別滴大約 20181。m深的濕制劑（見 節(jié)）的載玻片上。 178。 等到樣本停止懸?。?1 分鐘以內(nèi)）。 178。 用 200 或者 400 倍率的相差顯微鏡觀察載玻片。 178。 每個標(biāo)本大概評估 200 個精子左右，以便算出各自不同類型精子的百分比。 178。 若標(biāo)本的觀察值在可接受的范圍，記錄下數(shù)據(jù)， 否則重新制作標(biāo)本。 注 1： 該過程應(yīng)該在室溫或者顯微鏡載物臺預(yù)先加熱至 37℃ 的標(biāo) 準(zhǔn)試驗室內(nèi)進行，如果在 37℃ 下進行評估，精液樣本需要放置在 37℃ 環(huán)境中一段時間，并且制作標(biāo)本的載玻片、蓋玻片也應(yīng)該預(yù)熱至 37℃ 。 注 2： 建議采用帶有網(wǎng)格標(biāo)線的目鏡以便選擇觀察區(qū)域，先數(shù)積極運動型精子數(shù)量，然后數(shù)非積極運動型精子數(shù)量，最后評估完全不動型精子數(shù)量。（見 節(jié)）。 精子活力分類 建議采用一個簡單的精液運動分類方法，該方法根據(jù)精子運動功能的不同分成以下幾類： 178。 運動活躍型（ PR）：精子運動活躍、線性運動或者在較大的范圍內(nèi)運動（不考慮運動的速度）。 178。 非運動活躍型 (NP)：精子運 動但不活躍，如精子在較小的范圍內(nèi)運動，精子頭部輕微移位或盡有鞭毛擺動。 178。 完全不動型（ IM） ： 精子完全不動。 注 1： 該手冊之前的版本介紹的分類方法將積極活躍型根據(jù)精子運動速度的快慢進行細分，如將在 37℃ 下精子運動速度大于 25 微米 /秒的定義為 A 等，這種方法存在的不足之處是實驗人員很難客觀準(zhǔn)確的判斷觀察到的精子運動到底該歸到哪一等。 注 2： 當(dāng)討論精子活動率時，細分精子的總能動性（ PR+NP）和活躍精子能動性（ PR）非常重要。 精液樣本的準(zhǔn)備和評估 如果在 37℃ 的溫度下評估，提前 10 分鐘開啟恒溫箱 ，以確保溫度恒定在37℃ 。 準(zhǔn)備 20μm深的計數(shù)板（見 節(jié)）。 用 200 或者 400 倍率的相差顯微鏡觀察載玻片。 等到樣本停止懸浮。 在離蓋玻片至少 5μm 的區(qū)域內(nèi)觀察精子的運動（蓋玻片邊緣的精子運動性受到干燥物質(zhì)的影響）。 系統(tǒng)性地觀察載玻片以防止重復(fù)觀察同一個區(qū)域，不斷改變觀察區(qū)域，避免基于精子活動數(shù)量多少來選擇觀察區(qū)域（觀察區(qū)域選擇應(yīng)該隨機）。 計數(shù)開始時間的選擇應(yīng)該隨機，計數(shù)要迅速，不要等到精子游到所選區(qū)域后才開始計數(shù)。 評估所選區(qū)域的所有精子的活動率，區(qū)域選擇最好通 過目鏡標(biāo)線來確定，選擇區(qū)域的大小應(yīng)根據(jù)精液的濃度，如當(dāng)精液濃度較大時，選擇最上面一排網(wǎng)格，濃度低時，選擇全部的網(wǎng)格。 計數(shù)應(yīng)該迅速，避免運動精子的數(shù)量估計值比實際值多，快速計數(shù)網(wǎng)格內(nèi)的精子，避免因計數(shù)時間過長，將計數(shù)時游進網(wǎng)格的活動精子也計算入內(nèi)而導(dǎo)致估計值多于實際值。 首先數(shù)所選區(qū)域內(nèi)的運動活躍型精子（ PR），然后是非運動活躍型精子（ NP），最后是完全不動型精子（ IM）。根據(jù)經(jīng) 驗，也可以同時計數(shù)一個網(wǎng)格內(nèi)的三種類型的精子然后再數(shù)另一網(wǎng)格內(nèi) 的三種類型的精子，直到將所選區(qū)域數(shù)完。 通過實驗室計數(shù)器 的輔助完成計數(shù)。 每個標(biāo)本至少在 5 個不同的區(qū)域計數(shù)，所數(shù)的精子總數(shù)應(yīng)該不低于 200 個以避免小樣本錯誤。 分別計算兩個標(biāo)本的 PR、 NP 和 IM 比例，然后計算各自的均值和差值。 將計算的結(jié)果對照表 （在 95%的置信區(qū)間內(nèi)，在某一均值下，兩個比例差 距 可接受的最大值）。 參照表 若兩個比例差值在可接受范圍之內(nèi)，記錄 PR、 NP 和 IM 比例的 均值，若差值過大，超過可接受范圍，重新制作 2 個精液標(biāo)本。 通過四舍五入 記錄 PR、 NP 和 IM 比例均值的整數(shù)值。 注 1： 僅計數(shù)完整的精子（有頭部和尾部，見 節(jié)）不要計數(shù)只能看見小部分的精子 。 注 2： 活性精子計數(shù)時往