影響pcr擴(kuò)增因素的分析(編輯修改稿)
2025-07-26 02:18 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 本， 必須系統(tǒng)地探討基因組中DNA 的PCR反應(yīng)體系中各種因素對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響，對(duì)PCR 進(jìn)行優(yōu)化，以期為目地基因PCR 反應(yīng)成功提供穩(wěn)定可靠的方法。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行摸索，確定最佳的PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，排除人為因素（如加樣錯(cuò)誤），據(jù)此反應(yīng)體系和條件均能較好地?cái)U(kuò)增目標(biāo)片段。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR 反應(yīng)混合物成分的比例和PCR 反應(yīng)條件是PCR 反應(yīng)成功的關(guān)鍵，為了保證高質(zhì)量的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：①DNA 模板的要求；②引物與模板之間的比例，對(duì)PCR 的特異性也是非常重要的。③dNTP 濃度過高可加快反應(yīng)速度，但同時(shí)增加堿基的錯(cuò)誤摻入率即錯(cuò)配率和實(shí)驗(yàn)成本, 而低濃度的dNTP 會(huì)降低反應(yīng)速度以及產(chǎn)物量， 但可以提高實(shí)驗(yàn)的精確度。④PCR 反應(yīng)的緩沖液。 PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響受高溫、酸、堿、日曬、雨淋等環(huán)境因素的作用, 致使其人發(fā)DNA發(fā)生質(zhì)和量的變化, 影響DNA分析結(jié)果。用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)可對(duì)人體的一些組織, 如血痕、毛發(fā)及牙齒等進(jìn)行性別鑒定[4]。實(shí)驗(yàn)研究了溫度、濕度、pH、福爾馬林、乙醇和土埋處理牙齒的PCR擴(kuò)增, pH可影響DNA的穩(wěn)定性, 但pH在一定范圍仍較穩(wěn)定。pH過高或過低均可引起DNA 雙鏈間氫鍵的破壞而變性,甚至也可引起鏈內(nèi)共價(jià)鍵的破壞而發(fā)生DNA降解；福爾馬林固定組織可以破壞DNA分子, 固定時(shí)間越長(zhǎng)DNA 降解越多, 大部分DNA都降解成小片段,不適合RFLPs 分析?？傊瑢?shí)驗(yàn)最后證實(shí)溫度、pH等均會(huì)影響PCR擴(kuò)增。環(huán)境條件是復(fù)雜多樣的, 對(duì)檢材DNA的影響既可以是單因素作用, 也可能是多因素同時(shí)作用, 現(xiàn)僅報(bào)道部分理化單因素對(duì)人發(fā)DNA及其PCR性別鑒定結(jié)果的影響, 其他問題尚待進(jìn)一步研究。多重PCR要求不同引物能在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行特異性擴(kuò)增，因而影響其擴(kuò)增效果的因素較多，主要有循環(huán)參數(shù)、反應(yīng)體積、反應(yīng)體系、引物間的堿基配對(duì)等。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行不同循環(huán)參數(shù)、PCR緩沖液及反應(yīng)體積的對(duì)比，結(jié)果表明，循環(huán)參數(shù)中退火溫度和時(shí)間、延伸時(shí)間及PCR緩沖液的成分影響多重PCR 的擴(kuò)增效果，而反應(yīng)體積、循環(huán)次數(shù)對(duì)其擴(kuò)增效果影響較小。在常規(guī)PCR 中，一個(gè)反應(yīng)體系一般采用一個(gè)退火
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