【文章內(nèi)容簡介】 此法在CTAB比濁法未得到推廣以前一直應用廣泛。在實際測量中測得結果往往與實際情況不符，實驗證明中性糖的存在對測定結果又較大影響，因而在測量中要消除發(fā)酵液中中性糖的影響是十分必要的。 透明質酸的提取純度和相對分子量的高低決定了HA產(chǎn)品國際市場中的競爭力，下游分離純化工藝是獲得高純度、高分子量HA的關鍵環(huán)節(jié)[51]。由于含HA的發(fā)酵液粘稠度很高，不易將HA與菌體快速有效分離[52]，并且菌體發(fā)酵生產(chǎn)HA過程中所產(chǎn)生的透明質酸酶會降解HA，使HA分子量降低。故在進行HA產(chǎn)品分離純化時首先要對發(fā)酵液進行適當?shù)臐舛认♂?，盡快滅酶、滅菌、除菌等預處理[53]。分離工藝常用方法[54]有：乙醇分離，膜技術分離，殼聚糖分離。純化工藝主要有：季銨鹽純化，酶解純化，過濾法純化，離子交換層析純化，凝膠過濾柱層析純化。發(fā)酵液中分離純化HA一般是由多種分離純化方法共同完成的，單一的分離純化方法不能使HA產(chǎn)品達到很高的純化程度，并且每種分離純化方法也都存在一定的局限性[55]。因此，應根據(jù)發(fā)酵液的特性和分離純化方法的特點找到合適的分離純化工藝路線。 課題研究內(nèi)容和目的 本課題研究內(nèi)容（1）透明質酸產(chǎn)生菌的篩選鑒定和誘變選育。（2）優(yōu)化CTAB比濁法，建立一種更快捷、更精確、更準確和更高效HA含量檢測方法。（3）通過基因工程技術，對篩選到的菌株進行改造，獲得更安全高效的工程菌株。（4）尋找透明質酸發(fā)酵的最優(yōu)條件，研究添加劑對發(fā)酵生產(chǎn)HA的影響。 本課題主要目的篩選并鑒定產(chǎn)透明質酸的菌株，利用物理方法和化學試劑誘變除去菌株的溶血性，對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，降低菌株較為苛刻的營養(yǎng)要求，提高HA產(chǎn)量；對菌株的透明質酸合酶基因進行克隆和序列分析，對通過基因工程技術改造生產(chǎn)菌株進行必要的前期探索。2 透明質酸產(chǎn)生菌的分離、篩選與初步鑒定在微生物發(fā)酵生產(chǎn)透明質酸過程中，獲得優(yōu)良的菌種非常關鍵。目前報道的高產(chǎn)透明質酸菌株主要屬于鏈球菌類，而牛鼻粘膜是鏈球菌較容易生長的地方。本實驗采樣于連云港贛榆縣養(yǎng)牛場中的牛鼻粘膜共160份，目的在于從中篩選到一株透明質酸產(chǎn)生菌，并對其進行初步鑒定。 實驗材料 采樣連云港贛榆縣贛榆村養(yǎng)牛場牛鼻粘膜160份。 主要培養(yǎng)基及溶液組成 血瓊脂培養(yǎng)基葡萄糖的質量分數(shù)2%，Tryptone 1%，MgSO47 H2O %，KH2PO4 %，%，115℃滅菌20 min，冷卻至40℃以下，無菌條件下加入無菌脫纖維羊血。 搖瓶培養(yǎng)基葡萄糖的質量分數(shù)4%，Tryptone 1%，beef extract l%，MgSO47 H2O %，KH2PO4 %，115℃滅菌20 min，冷卻至40℃以下，無菌條件下加體積分數(shù)10%的小牛血清。 斜面培養(yǎng)基牛腦浸液800 mL，牛心浸液200 mL，beef extract %，Tryptone %，NaCl %，%，pH ，121℃滅菌20 min。 種子培養(yǎng)基%，Tryptone %，Yeast extract %，NaH2PO4 %，NaCl %，滅菌前pH ，115℃滅菌20 min。 呂氏美藍染液A液：美藍（Methylene blue，又名甲烯藍） g，95%乙醇 30 mL。B液： g/L KOH溶液 100 mL?；旌螦液和B液即成，用于細菌單染色，可長期保存。根據(jù)需要可配成稀釋美藍液，按1:10或1:100稀釋均可。 革蘭氏染色所用染液① 結晶紫(crystal violet)液：A． 結晶紫 2 g 乙 醇 20 mLB． 草酸銨 g 蒸餾水 80 mL將A、B液相混合，放置24 h后使用。此液比較穩(wěn)定，可保存數(shù)月。② 碘液：取1 g碘片與2 g KI相混，加12 mL蒸餾水研磨，然后可再加34 mL蒸餾水研磨，直到碘片溶解為止。然后將此液用少量的蒸餾水洗入貯瓶內(nèi)，并補足到總量為100 mL蒸餾水，即為碘液母液。此溶液穩(wěn)定，可放置數(shù)月。使用時，取1份上述碘液加2份蒸餾水，即為革蘭氏染色用碘液。③ 95%乙醇：用于脫色。④ 番紅花紅液： g，95%乙醇100 mL，溶解后可貯存于密閉的棕色瓶中，用時取20 mL與80 mL蒸餾水混勻即可。 實驗方法菌種的篩選流程：牛鼻黏膜 稀釋涂平板 初篩菌株 純種分離 復篩菌株 發(fā)酵液HA提取 定性分析 目的菌株 斜面培養(yǎng) 菌種鑒定 透明質酸的分離純化 透明質酸的粗提發(fā)酵液6000 rmp離心10 ，攪拌20 min，經(jīng)多次乙醇分級沉淀后得到HA粗品。 CTAB絡合 mol/L NaCl溶液中，加入體積分數(shù)10%的十六烷基三甲基溴化銨，攪拌30 min后靜置1 h，6000 rpm離心10 min得到沉淀絡合物。 HA精提不同濃度的NaCl解離沉淀絡合物，離心去除沉淀，沉淀在五氧化二磷存在下常溫真空干燥得HA精品。 菌種的篩選 采樣棉簽采集牛鼻粘膜160份，此處是鏈球菌容易生長的地方。 初篩%的蛋白胨溶液，用梯度稀釋倍數(shù)法將牛鼻黏膜稀釋成不同的濃度，涂布棒均勻涂布于血瓊脂平板培養(yǎng)基，放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌落的溶血性和形態(tài)。 分離純化血瓊脂平板上挑取溶血素缺陷型菌株，作為初篩疑似菌株進行劃線分離，將血平板在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。挑取單菌落進行美蘭染色，顯微鏡觀察，若菌落中有雜菌存在，則繼續(xù)劃線分離，再培養(yǎng)，直到染色后菌落單一無雜菌。 復篩將初篩疑似菌株接入搖瓶培養(yǎng)基中，每株2瓶，120 rpm/min，37℃的搖床中空氣振蕩培養(yǎng)24 h，復篩發(fā)酵液進行HA精提，對得到的多糖精品紅外吸收光譜定性分析。 菌種的初步鑒定根據(jù)鏈球菌常用的鑒定方法，進行菌株的培養(yǎng)特征和生長特征觀察。 菌落培養(yǎng)特征純化好的菌種，用接種環(huán)接種于血瓊脂平板培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，進行菌落形態(tài)和溶血性觀察。 菌種的鏡檢選擇在基本培養(yǎng)基上生長的細菌，經(jīng)染色后，在顯微鏡下測量菌體的大小，觀察菌體的形狀、排列方式或分枝的情況等，觀察細菌的革蘭氏反應，有無莢膜等。 實驗結果與討論 菌種的篩選 初篩結果%的蛋白胨溶液稀釋成不同濃度后，分別涂于血瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，在兩塊平板上分別發(fā)現(xiàn)3株明顯溶血性菌種，從圖21和22中可以看出平板2中的菌落周圍形成34 mm寬、界限清晰、完全透明的溶血環(huán)，說明該菌株溶血性較強，而平板1中的菌落周圍形成12 mm寬、不完全透明的溶血環(huán)。根據(jù)相關資料報導，HA產(chǎn)生菌一般分為乙型溶血性鏈球菌，甲型溶血性鏈球菌以及無溶血現(xiàn)象的丙型鏈球菌。初步推斷平板1中菌落為乙型溶血，平板2中菌落為甲型溶血。 圖 21 乙型溶血菌落 圖22 甲型溶血菌落Fig 21 βhemolytic streptococcus Fig 22 α hemolytic streptococcus 復篩結果血瓊脂平板上挑取溶血素缺陷型菌株，作為初篩疑似菌株進行劃線分離，將血平板在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。挑取單菌落進行美蘭染色，顯微鏡觀察，若菌落中有雜菌存在，則繼續(xù)劃線分離，再培養(yǎng)，直到染色后菌落單一無雜菌。3只250 mL錐形瓶，分別裝入50 mL搖瓶培養(yǎng)基，并接入初篩疑似菌株，將錐形瓶放入37℃空氣浴搖床中，搖床轉速200 rpm/min，進行發(fā)酵培養(yǎng)24 h。采用HA精提法對發(fā)酵液進行分離提純，用紅外分光光度計對得到的多糖精提物產(chǎn)物進行定性分析。圖23 HA標樣紅外吸收圖譜Fig 23 Infrared absorption spectrum of HA standard sample圖24 HA精提物紅外吸收圖譜Fig 24 Infrared absorption spectrum of HA refined extracts從圖24可以看出，發(fā)酵液多糖精提物的紅外吸收圖譜在3420 nm附近有強OH伸縮振動的特征吸收峰，說明有多羥基結構；在2920 nm附近有CH2的伸縮振動的特征吸收峰，1650和1560 nm處有CO、CN的伸縮振動的特征吸收，表明含有乙酰氨基結構；在141310 nm處有COC的伸縮振動和OH的彎曲振動耦合產(chǎn)生的2個吸收峰，表明存在著有解離羧基結構和多糖羥基結構的糖醛酸。篩選菌株的發(fā)酵液精提物呈較典型的HA紅外吸收圖譜，可以確定該發(fā)酵液多糖精提物為透明質酸。根據(jù)以上分析，也可以進一步確定篩選得到的鏈球菌可以產(chǎn)生HA。 菌種的分類鑒定菌落周圍有透明的溶血圈，菌落直徑12 mm，透明度很高，灰白色隆起，接種環(huán)挑起呈蛋清狀黏連。 菌種鏡檢結果細菌染色鏡檢，篩選菌株在固體平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，培養(yǎng)物大部分為短鏈成對或聚集成叢的葡萄球菌，接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，培養(yǎng)物則基本呈長鏈狀。革蘭氏染色呈陽性，濕墨汁法莢膜染色后鏡檢，發(fā)現(xiàn)有明顯莢膜。圖25 革蘭氏染色Fig 25 Gram stain 本章小結從取自連云港贛榆養(yǎng)牛場的牛鼻黏膜中成功篩選到一株透明質酸產(chǎn)生菌，根據(jù)菌落形態(tài)特征，溶血性，以及染色結果，初步鑒定為獸疫鏈球菌。通過搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，分離提取發(fā)酵液中的透明質酸，得到多糖粗品，紅外光譜掃描顯示此多糖為透明質酸。3 透明質酸含量檢測方法建立高效快速地測定發(fā)酵液中HA的含量不僅能提高篩選透明質酸高產(chǎn)菌株的效率，而且對發(fā)酵條件的優(yōu)化及工藝控制有非常重要的意義。目前最常用的測定發(fā)酵液中HA含量的方法是BitterMuir法，其原理是用強酸將HA裂解成單糖單位，通過葡糖醛酸與咔唑顯色反應間接測定HA含量。最近有報道采用更簡便的CTAB比濁法，其原理是HA在溶液中可與十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等陽離子表面活性劑發(fā)生絡合反應，產(chǎn)生混濁現(xiàn)象，并在一定濃度范圍內(nèi)遵循朗伯比爾定律。本實驗對上述兩種方法分別進行優(yōu)化，并比較二者用于檢測發(fā)酵液中HA含量的優(yōu)劣。 實驗材料 主要儀器SZ3型自動三重純水蒸餾器 上海滬西分析儀器廠有限公司KTFDL1封閉式可調(diào)電爐 上海賀德實驗設備有限公司FA1104電子分析天平 上海精密科學儀器有限公司G53紫外可見分光光度計 上海棱光技術有限公司DHG9104A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司HZQC型空氣浴振蕩器 哈爾濱市東明醫(yī)療器械廠TGL16B高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠 主要試劑（1）透明質酸標準品（醫(yī)用級）；（2）發(fā)酵液： g/L蛋白胨， g/L酵母粉， g/L葡萄糖，2 g/L NaCl， g/L Na2HPO4；（3）CTAB溶液： g CTAB溶于100 mL 2%NaOH溶液中， g CTAB溶于100 mL 2%NaCl溶液中；（4）咔唑試液：25 mg咔唑溶于20 mL無水乙醇中；（5）乙酸緩沖溶液： mol/L CH3COONa， mol/L NaCl，；（6）磷酸緩沖溶液： mL mol/L NaH2PO， mol/L Na2HPO4；（7）TrisHCl緩沖液：50 mL mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris） mL mol/L 鹽酸混勻后，加水稀釋至100 mL。 實驗方法 透明質酸的初步純化%（w/v）十二烷基磺酸鈉（SDS）等體積混合，室溫溫浴10 min以釋放細胞外壁附著的HA。經(jīng)4500 r/min離心10 min，去除菌體，取上清液，在4℃靜置1 h，12000 r/min離心取沉淀，加入與發(fā)酵液等體積的去離子水溶解[56]，取1 mL進行HA測定。 CTAB比濁法適量濃度的透明質酸溶液與乙酸緩沖液混合，終體積為1 mL，室溫加入2 mL一定濃度的CTAB溶液均勻混合，反應一定時間后在特定波長下測定混合液的濁度A。根據(jù)A與HA濃度之間的線性關系，繪制標準曲線。 改良BitterMuir法3 mL濃硫酸置于試管中，1 mL樣液或HA標準液小心置于濃硫酸上層，開始輕輕振搖，然后劇烈振搖，并使之在冰浴中不斷冷卻，將試管在沸騰的去離子水中加熱一定時間， mL咔唑試液，再次搖勻，在沸水浴中加熱一定時間，冷卻至室溫，在特定波長下測定吸光度A。 結果與討論 CTAB比濁法 緩沖溶液對反應體系的影響為考察不同緩沖溶液對HACTAB反應體系吸光度的影響，本實驗分別稱取9 mg HA標準品溶解于100 mL乙酸緩沖液、磷酸緩沖液、TrisHCl緩沖液和去離子水中，配制成濃度均為90 181。g/mL的HA標準液。并分別與25 g/L的CTAB溶液反應10 min，在200800 nm波長范圍內(nèi)進行掃描。實時譜圖顯示不同緩沖溶液對HACTAB反應體系的吸光度值基本無影響。因此，為了節(jié)約試劑，簡化實驗步驟，后續(xù)實驗采用去離子水配制HA標準液。 CTAB溶液配制對反應體系的影響本實驗考察了CTAB溶液的配制對HACTAB反應體系吸光度的影響。濃度為90 181。g/mL的HA標準溶液分別與25 g/L CTAB(NaCl)溶液和25 g/L CTAB(NaOH)溶液反應10 min，在200800 nm波長范圍內(nèi)進行掃描。由圖31可知，HACTAB(NaCl)反應體系的吸光度非常小，接近于CTAB溶液的吸光值，基本觀察不到混濁現(xiàn)象；而HACTAB(NaOH)反應體系的吸光度較大，混濁現(xiàn)象明顯。說明在堿性條件下，HA與CTAB的絡合反應較充分。另外，吸光度太小，實驗誤差對測量結果的影響較大。因此，后續(xù)實驗采用將CTAB溶于NaOH溶液。圖31 不同C