【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 A3’iPCR 特異性引物NHXR：5’TCACCTGGAATCCCGCAT3’NHXF：5’ ATTTGAACACCAGCTCGGCTTT3’ 載體及菌株（1）pMD18T Vector （TaKaRa），可利用M13RV引物和M13M4引物進(jìn)行測(cè)序，同時(shí)含有編碼β半乳糖苷酶（lacZ）α肽的基因，可以根據(jù)α互補(bǔ)原理通過插入失活顯色對(duì)重組子進(jìn)行篩選。（2） DH5α菌 主要儀器設(shè)備及其他RNase A、dNTP、MgClTaq DNA聚合酶等購(gòu)自TaKaRa公司或上海生物工程公司，苯酚、丙酮、氯仿、β巰基乙醇Tris、EDTA、NaCl、MgClCaClNaOH、NaAc、IPTG、Xgal、氨芐青霉素（Amp）等為上海Sagon、invitrogen或國(guó)藥等公司。PCR儀BIORAD C1000Tm Thermal Cycler、 電子天平 sartorius BS223s 、微波爐 G7020IIYSLV1 、電泳儀 DYY6D型、 渦旋振蕩器QILIBEIER QL861 VORTEX SHAKER 、QILIBEIER VORTEX5 型、LX200 迷你離心機(jī)、TG16AW 微量高速離心機(jī)、TGL16M 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、eppendorf centrifuge 5415 R、高壓滅菌鍋 AUTO clave HVE50、SANYO MDFU32V 超低溫冰柜、UVitec 凝膠成像系統(tǒng)、TH2C1臺(tái)式冷凍恒溫振蕩器。 實(shí)驗(yàn)方法 兼并引物設(shè)計(jì)利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查找不同植物NHX1基因的氨基酸序列，比對(duì)同源性（Clustal W），根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計(jì)兼并引物（其中R=A/G,Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G,W=A/T,H=A/C/T,B=C/G/T,=A/C/G,D=A/G/T,N=A/C/G/T）。同時(shí)考慮引物本身的GC含量（與TM值有關(guān)）和其他引物設(shè)計(jì)原則。根據(jù)GenBank公布的擬南芥、玉米、苜蓿、鹽芥等植物的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列，ClustalX軟件進(jìn)行多序列同源性比對(duì)。在高度保守區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)一對(duì)兼并引物，由invitrogen公司合成，序列如下：DegNHXF：5’ CCICCIATHATHTTYAAYGCIGG 3’DegNHXR：5’ –RTAIGCCATIARCATCAT 3’肌動(dòng)蛋白的兼并引物則采用已發(fā)表文獻(xiàn)克隆水稻actin 基因的序列，序列如下：DegAct1：5’ ATGGTIAARGCIGGITTYGC 3’DegAct2：5’ CCACATYTGYTGRAAIGTIS 3’ 為七種Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果（AtNHX1，ThNHX1，BnNHX1，ZmNHX1，AgNHX1，SSNHX1，MsNHX1分別為擬南芥、鹽芥、油菜、玉米、濱藜、鹽地堿蓬和苜蓿的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列，DQ995339，，,，）?！?”表示保守，“：”表示次保守，箭頭所示為兼并引物位置。 白刺總RNA的提取及鑒定【33】（1）65℃預(yù)熱10ml2%CTAB提取緩沖液（%β巰基乙醇）；（2）液氮中研磨1g新鮮植物組織；（3）在研缽中加入預(yù)熱的CTAB提取液，解凍后用剪寬了的槍頭移入10ml離心管中，干式恒溫器中65℃孵育15min；（4）加入等體積的氯仿/異戊醇（24：1）并渦旋混勻10min，6000 rpm離心10min；（5）將上清轉(zhuǎn)移至一新離心管中，重復(fù)抽提一次；（6）將上清轉(zhuǎn)移至一新離心管中，加入1/4 體積LiCl,4176。C下沉淀過夜；（7）4℃ 6000rpm離心10min，棄上清，用1mL TE buffer溶解沉淀，加入等體積水平衡苯酚，冰浴5min；（8）8000rpm 離心10 min，取上清，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）抽提一次；（9）加入等體積的氯仿/異戊醇（24：1）抽提，取上清；（10）可重復(fù)操作上步驟，直到看不到中間層；（11），加入1/4體積LiCl，20℃沉淀2h；（12）4℃ 6000rpm離心10min，棄上清，加500 μL70%乙醇洗沉淀，吹干后用30μLDEPC水或TEbuffer溶解RNA。 RNA的變性瓊脂糖凝膠電泳甲醛瓊脂糖凝膠電泳參照《分子克隆手冊(cè)》（第三版）的方法進(jìn)行，%，檢測(cè)總RNA的完整性。紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA在260nm和280nm處的光吸收值（OD值），確定RNA的純度及濃度，再根據(jù)其濃度計(jì)算RNA 電泳加樣量，RNA電泳加樣 35 mg。（1）%的瓊脂糖凝膠（50mL）Agarose 加熱溶解冷卻至5060℃ 10 mops 5ml 加入甲醛9mlDEPC water 36ml注入凝膠托盤（2）電泳緩沖液 total 650mlDEPC water 585ml10mops 65ml （3）上樣緩沖液DEPC水 50mlDeionized formamide (去離子甲酰胺) 500ml 10MOPS 50mlformaldehyde（甲醛） 175 ml（4）泳動(dòng)sample 處理 RNA＋DEPC water 10 ml 65 ℃ for 10 minSample buffer 10ml 冰浴 3min Add 2ml BPB buffer 電泳 cDNA第一鏈的合成本實(shí)驗(yàn)中采用TaKaRa RNA PCR Kit（AMV），以白刺總RNA為模板，Oligo（dT）為引物，在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA第一鏈，反轉(zhuǎn)錄體系如下：（1）反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)MgCl2 (25mM) 2μl10 RT Buffer 1μl[100mM TrisHcl (pH ),500mM Kcl]RNase Free dH2O dNTP Mixture(各10mM) 1μlRNase Inhibiter (40 U/μl) AMV Reverse Transcriptase XL（5U/μl） Oligo dTAdaptor primer() 。 Positive Control RNA 1 μlTotal 10μl /Sample（2）反應(yīng)條件30℃ 10min42℃ 30min 1 Cycle99℃ 5min4℃ 5min+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因cDNA片段的克隆PCR反應(yīng)體系：10X PCR Buffer dNTP（） 2μLdegNHXF（50μm） 1μLdegNHXR（50μm） 1μLcDNA 2μLrTaq DNA polymerase dd H2O total 25μL按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)94℃ 2min94℃ 30s45℃ 1min 35 cycle72℃ 30s 72℃ 5minPCR結(jié)束后，取5ｕlPCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，120V電壓，泳動(dòng)30min后，經(jīng)溴化乙錠染色10min，凝膠成像系統(tǒng)照相檢測(cè)是否擴(kuò)增出目的條帶（500bp）。如果要使目的片段的PCR產(chǎn)量增多，可進(jìn)行二次PCR反應(yīng)，即以一次PCR產(chǎn)物為模板，再次進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)可驗(yàn)證目的條帶是否為目的基因。(1)反應(yīng)體系10X PCR Buffer dNTP（） 2μLdegActF（20μm） degActR（20μm） cDNA 2μLrTaq DNA polymerase dd H2O total 25μL按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)94℃ 2min94℃ 30s45℃ 1min 35 cycle72℃ 1min 72℃ 5minPCR結(jié)束后，取5ｕlPCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，120V電壓，泳動(dòng)30min后，經(jīng)溴化乙錠染色10min，凝膠成像系統(tǒng)照相檢測(cè)是否擴(kuò)增出目的條帶（1000bp）。（TB法）（1）,在LB平板上劃線,37度過夜至長(zhǎng)出單菌落，（2）挑直徑13毫米的單菌落,接種到250毫升錐形瓶SOB培養(yǎng)基，培養(yǎng)基量不可再多,會(huì)影響效率，（3）在18度150250RPM 培養(yǎng)1950小時(shí)沒有冷卻搖床的可在室溫, 但不可高于37度，, 放在冰水中冷卻10分鐘（4）4度,4000 rpm離心10分鐘, 回收菌體，（5）去掉上清后, 用1/3體積的冰冷TB溶液懸浮, 預(yù)冷10分鐘，再次離心回收菌體，（6）用1/, 添加最終濃度為7%的DMSO, 再冷卻10分鐘，（7），70℃超低溫儲(chǔ)存。 PCR產(chǎn)物的凝膠回收及TA克隆的與轉(zhuǎn)化取20ｕl %瓊脂糖凝膠電泳分離，120V恒壓泳動(dòng)30min，用AxyGEN公司的DNA瓊脂糖凝膠產(chǎn)物回收試劑盒回收目的片段。、采用AxyGEN公司的PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，方法如下：（1）電泳結(jié)束后用潔凈的刀片在長(zhǎng)波紫外燈下切下含有目的ONA片段的瓊脂糖凝膠，計(jì)算凝膠重量，該重量作為一個(gè)凝膠體積。（2）加入3個(gè)凝膠體積的 BufferDEA，混合均勻后于75℃加熱，間斷混合(每23min)，直至凝膠塊完全熔化(約6 8min)。（3） DEA體積的BufferDEB，混合均勻。當(dāng)分離的DNA片段小于400bp時(shí)，加入1個(gè)凝膠體積的異丙醇。（4）吸取步驟(3)中的混合液，轉(zhuǎn)移到DNA制備管(置于 2ml(試劑盒內(nèi)提供)離心管)中，室溫下靜置1min，12000轉(zhuǎn)離心 1min。棄濾液。（5）將制備管置回2ml離心管，加500μlBuffer Wl,12000轉(zhuǎn)離心305，棄濾液。（6）將制備管置回 2ml離心管，加700μl BufferW2，12000轉(zhuǎn)離心305，棄濾液。以同樣的方法再用700μlBufferW2洗滌一次12000轉(zhuǎn)離心1min。（7）將制備管置回2ml 離心管中，12000轉(zhuǎn)離心1 min。（8）將制備管置于潔凈的105ml離心管中，室溫干燥12min，在制備膜中央加2530μl Eluent（65℃預(yù)熱），室溫靜置1min。12000轉(zhuǎn)離心1 min洗脫DNA。、PCR膠回收產(chǎn)物與pMD18T載體的連接（1）連接體系如下：pMD18T vector PCR 產(chǎn)物 Solution I 5μLTotal 10μL（2）將上述混合液輕輕振蕩后短暫離心，16℃水浴保溫過夜、pMD18TNHX和pMD18TAct 轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞（1）事先將干式恒溫器的溫度調(diào)到42℃，并取適量的冰塊。（2）從80℃超低溫冰箱中取出一管50μl的DH5α感受態(tài)細(xì)菌，迅速插入冰中融化，冰浴10min。（3）加入10μl連接好的pMD18TNHX及pMD18TAct混合溶液，輕輕震蕩后放置到冰上30min。（4）輕輕搖勻后插入42℃ 60s進(jìn)行熱休克，然后迅速放回冰中，靜置35min。（5）在超凈工作臺(tái)中向上述管中加入890μL SOC培養(yǎng)基（不含抗菌素）輕輕搖勻，然后固定到搖床上37℃震蕩60min。（6）3000rpm短暫離心，棄上清，加入40μl的2%的Xgal，7μl的20% IPTG混勻。（7）在超凈工作臺(tái)中將上述轉(zhuǎn)化混合溶液，滴到含有AMP的固體LB平板培養(yǎng)皿中。然后從酒精中取出玻璃棒，在火上點(diǎn)燃，稍等片刻，待其冷卻之