【文章內(nèi)容簡介】 相互吸引的。相對于卵磷脂囊泡，混合體系囊泡更加穩(wěn)定。膽固醇作為表面活性劑使油包水乳液能穩(wěn)定形成，膽固醇嵌入脂質(zhì)體膜使得脂質(zhì)體顆粒膨大，內(nèi)水相也將相應增大，但當膽固醇比例過大時，組成的脂質(zhì)體的磷脂的量太少，一方面脂質(zhì)體微囊膜形成困難，另一方面所形成的脂質(zhì)體膜也會變得不牢固，過高膽固醇使得脂質(zhì)體膜親水性太強，膜容易破壞，其中包含物將很容易滲漏出來 [2]。圖14 脂質(zhì)體的形成 膽固醇影響脂質(zhì)體膜性質(zhì)的原理膽固醇的一端是親水的羥基，另一端是甾醇環(huán)和疏水環(huán)基鏈，是一種兩親分子。其本身是構成脂質(zhì)體的重要組成。在脂質(zhì)體中，膽固醇鑲嵌于磷脂分子之間，膽固醇的羥基端與磷脂的頭基相結合，另一端插入雙分子層疏水烷基鏈中。膽固醇與磷脂雙分子層的作用分為兩種：一種為羥基與磷脂頭基間的氫鍵作用，另一種為甾醇環(huán)烷基鏈結構在磷脂疏水鏈之間的填充作用 [7]。適量的膽固醇可以增加磷脂脂質(zhì)體膜的剛性，增加其穩(wěn)定性，但過量的膽固醇會使雙分子層超過可容納的限度，造成雙分子層的破壞，使磷脂脂質(zhì)體失去穩(wěn)定的結構，最終導致破裂。 膽固醇—脂質(zhì)體混合體系的研究目前對于膽固醇—脂質(zhì)體混合體系的研究，一般采用研究其特征參數(shù)（脂質(zhì)體粒徑，脂質(zhì)體微極性，脂質(zhì)體膜流動性等）的方法，本次研究將針對脂質(zhì)體在加入了膽固醇之后的抗氧化能力以及其他各種理化指標的變化，以達到得出膽固醇最適添加量的目的。 TBA（硫代巴比妥酸）法TBA法的原理是脂質(zhì)過氧化的降解產(chǎn)物之一一丙二醛(MDA)，可以與硫代巴比妥酸成色。在520nm處進行比色測定，可檢測丙二醛相對含量的變化，以了 解生物膜質(zhì)過氧化的情況。 TBA法是一非常簡便的方法，一般實驗室均可進行。此法與熒光法、化學發(fā)光法等有較好的相關性，但不足之處是靈敏度較差，某些因素應加以控制，如線粒體污 染，樣品中的鐵離子等 [8]。經(jīng)過TBA法處理過的磷脂脂質(zhì)體樣品一般呈粉紅色，被氧化程度越高，丙二醛的含量越高，顏色越升，于分光光度儀上所測得的吸光值也就越深。 DSC（差示掃描熱量儀）測定相變溫度1）脂質(zhì)體相變溫度的定義脂質(zhì)體膜雙分子層由排列整齊且致密的膠晶態(tài)變?yōu)槭杷苫靵y的液晶態(tài)，這一轉(zhuǎn)變我們即稱之為脂質(zhì)體的相變溫度。2）DSC（差示掃描熱量儀）差示掃描熱量儀（differential scanning calorimetry）是一類在嚴格控制程序溫度下，測量輸入（或取出）試樣和參比物的平衡熱量差儀器。通過對樣品的變溫熱分析狀況，可以檢測出脂質(zhì)體的相變溫度時的熱量釋放情況。相變溫度對于熱敏感脂質(zhì)體來說是相當重要的一個參數(shù)，直接關系到脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。當脂質(zhì)體處于“液晶”態(tài)時，膜的橫切面增大，雙分子層厚度減少，膜流動性增加，從而使被包裹在脂質(zhì)體內(nèi)的藥物透膜速度增加，使脂質(zhì)體不穩(wěn)定，因此較高的相變溫度有利于維持脂質(zhì)體的穩(wěn)定 [9]。而某些熱敏脂質(zhì)體正是利用了其對溫度敏感的特征。這一類脂質(zhì)體的相變溫度通常略高于37攝氏度。當處于常溫時，這一類脂質(zhì)體處于膠晶態(tài)，結構穩(wěn)定能夠很好的達到保存藥物的功能，而當被服用了之后，到達了溫度較高的靶向部位時，由于溫度超過了脂質(zhì)體的相變溫度，脂質(zhì)體相變?yōu)橐壕B(tài)，此時就將其包埋的有效成分釋放出來，成功的作用于靶向部位。 差示掃描熱量儀工作原理圖 脂質(zhì)體的粒徑與納米粒徑儀粒徑是脂質(zhì)體形態(tài)學中很重要得一項指標，粒徑大小直接影響到了脂質(zhì)體的各方面的性質(zhì)。特別在作為抗癌藥物的載體時，脂質(zhì)體的粒徑直接影響了藥物的靶向性，釋放速率及治療效果。一般認為，粒徑較小的脂質(zhì)體更為穩(wěn)定 [9]。在生產(chǎn)實驗過程中，一般可以采用超聲等手段減小脂質(zhì)體的粒徑。 不同的包埋物對于磷脂脂質(zhì)體的粒徑要求也不同，如：當藥物為口服藥時，粒徑較小的脂質(zhì)體更能夠促進藥物有效成分的吸收，因此要求粒徑更小的脂質(zhì)體。通過超聲、均質(zhì)均可以減小磷脂脂質(zhì)體的粒徑。一般情況下，再添加了適量的膽固醇后磷脂脂質(zhì)體的粒徑會增大，但膽固醇濃度過大時，會造成磷脂脂質(zhì)體粒徑的急劇減小。此內(nèi)容詳見第二章。 納米粒度儀是用物理的方法測試固體顆粒的大小和分布的一種儀器，采用數(shù)字相關器的納米激光粒度儀，其采用高速數(shù)字相關器和高性能光電倍增管作為核心器件，具有操作簡便、測試快捷、高分辨、高重復及測試準確等特點，是納米顆粒粒度測試的首選產(chǎn)品。 圖 納米粒度儀原理圖 熒光分析技術熒光分析是指利用某些物質(zhì)在紫外光照射下產(chǎn)生熒光的特性及其強度進行物質(zhì)的定性和定量的分析的方法。()發(fā)現(xiàn)熒光，真正的熒光光譜測量則始于本世紀60年代 [10]。熒光定量分析常采用直接比較法，將試樣與已知物質(zhì)同時放在紫外光源下，根據(jù)它們所發(fā)熒光的性質(zhì)、顏色和強度，鑒定它們是否含有同一熒光物質(zhì)。某些物質(zhì)在加入某種試劑后，其產(chǎn)物會產(chǎn)生熒光，也可采用同樣方法鑒定。最常用的方法是用熒光分光光度計繪制試樣的熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜，并與已知物質(zhì)的這兩種光譜進行比較，從而鑒定所含成分 [11]。膜類物質(zhì)并不產(chǎn)生熒光，因此，人們通常用一些能自發(fā)進入膜中非極性鏈區(qū)域的熒光團去標記它們。其中，使用最普遍的就是1，6一二苯基一1，3，5一己三烯(DPH)，由于其在水中的低溶解和低發(fā)射性質(zhì)，DPH只有存在于膜結構中才能發(fā)出熒光。 DPH及其衍生物廣泛應用于研究膜流動性等 [10]。本次研究中采用了芘和DPH作為熒光探針分別測定磷脂脂質(zhì)體膜的微極性和流動性。芘：有機化合物，淡黃色單斜晶體（純品為無色），具有芳香，可燃，不溶于水，易溶于乙醇、乙醚?？蛇M行親電取代，如鹵化、硝化、磺化等反應。芘主要存在于煤焦油瀝青的蒸餾物中。芘為有機合成原料，經(jīng)氧化可制取1,4,5,8萘四甲酸，用于染料、合成樹脂、分散性染料和工程塑料；酰化后可制還原染料艷橙GR及其他多種染料。還可制殺蟲劑、增塑劑等。 DPH：黃色片狀結晶。溶于熱丙酮，微溶于苯、氯仿和冷丙酮，不溶于水、乙醇和乙醚等。熔點200～203℃ 。有刺激性。 圖 17 發(fā)光機理 圖 18 典型的熒光物質(zhì)結構 國內(nèi)外研究進展脂質(zhì)體最初是由英國學者Bangham和Standish將磷脂分散在水中進行電鏡觀察時發(fā)現(xiàn)的。磷脂分散在水中自然形成多層囊泡，每層均為脂質(zhì)的雙分子層；囊泡中央和各層之間被水相隔開，雙分子層厚度約為4納米 [3]。后來，將這種具有類似生物膜結構的雙分子小囊稱為脂質(zhì)體。1971年英國萊門等人開始將脂質(zhì)體用于藥物載體 [1]。 , , 進行研究，并初步確定了膽固醇通過嵌入磷脂雙分子層中以達到穩(wěn)定脂質(zhì)體結構，加強抗氧化作用的機理。隨著電子顯微鏡技術的成熟，人們能夠更清晰的觀察到了膽固醇影響脂質(zhì)體膜性質(zhì)的機理 [12]。由于脂質(zhì)體的主要作用是作為有效成分，如藥物，的載體，使有效成分能夠在體內(nèi)緩慢釋放，提高有效成分作用效率，能與我國的傳統(tǒng)中藥完美結合。國內(nèi)學者已于20世紀80年代陸續(xù)開始將我國中草藥中的有效成分進行脂質(zhì)體包埋的研究，如雙參脂質(zhì)體口服液 [13]、冬蟲夏草脂質(zhì)體口服液 [14]、人參皂苷脂質(zhì)體 [15][16]、黃氏多糖脂質(zhì)體 [17]、人參多糖脂質(zhì)體 [18]、丹參酮前體脂質(zhì)體 [19]、三七總皂苷脂質(zhì)體 [20]等已在制備方法和醫(yī)學性質(zhì)上進行了深入的研究。目前，國外也已將脂質(zhì)體成功的應用于食品工業(yè)，如乳鐵傳遞蛋白脂質(zhì)體用于食品的抗菌、卵黃高磷蛋白脂質(zhì)體用在乳品和干肉中放置脂質(zhì)氧化、維生素C脂質(zhì)體用于降低失活。許多用于治療癌癥、抗真菌的脂質(zhì)體藥物已經(jīng)被批準用于臨床研究 [4][5][8]。膽固醇目前作為脂質(zhì)體制備中不可缺少的一種成分，已經(jīng)越來越受到國內(nèi)外研究學者的重視。 本研究的主要內(nèi)容與意義 立題背景與意義脂質(zhì)體作為一種有效成分的載體，能夠起到靶向定位，緩釋有效成分，降低毒性的作用。在脂質(zhì)體溶液中加入膽固醇可以明顯提高脂質(zhì)體的抗氧化能力，并改變脂質(zhì)體的一些其他性質(zhì)。目前所做的研究大多為如何使有效成分和脂質(zhì)體相融合，但對于添加多少膽固醇能夠在增加脂質(zhì)體的抗氧化能力的同時又不影響其包埋有效成分的能力甚至能增強其靶向定位，降低毒性的能力，現(xiàn)在尚無定論。本研究的目的就是通過實驗研究不同膽固醇濃度的脂質(zhì)體溶液的性質(zhì)，以得出膽固醇的最適添加量，從而為脂質(zhì)體的制備提供依據(jù)，并為下一步——植物固醇代替膽固醇，提供參考 [21][22]。 本課題研究的主要內(nèi)容1）制備以膽固醇為調(diào)節(jié)劑的卵磷脂脂質(zhì)體；2）測定不同貯藏天數(shù)的脂質(zhì)體的TBA變化，以確定膽固醇的添加量對于脂質(zhì)體氧化穩(wěn)定性的影響；3）使用納米粒徑儀測定脂質(zhì)體的粒徑；4）采用DSC（差示掃描熱量儀）測定脂質(zhì)體的相變溫度；5）利用芘為熒光探針法進行脂質(zhì)體的微極性研究；6）測定以DPH為熒光探針的不同比例膽固醇的脂質(zhì)體的熒光光譜，從而研究脂質(zhì)體的膜的流動性。第 2 章 實驗材料與方法 實驗材料與主要儀器 試劑試劑名稱 生產(chǎn)廠家大豆磷脂（Pc90） 江蘇曼氏生物科技有限公司磷酸氫二鈉（AR） 國藥集團化學試劑有限公司磷酸二氫鈉（AR） 國藥集團化學試劑有限公司甲醇（AR） 國藥集團化學試劑有限公司三氯甲烷（AR） 國藥集團化學試劑有限公司無水乙醇（AR） 國藥集團化學試劑有限公司膽固醇（AR） 國藥集團化學試劑有限公司芘，﹪ Aldrich 產(chǎn)品硫代巴比妥酸 國藥集團化學試劑有限公司三氯乙酸 國藥集團化學試劑有限公司濃鹽酸（AR） 國藥集團化學試劑有限公司 實驗儀器設備儀器名稱 生產(chǎn)廠家