脂肪酶的概述與應用(編輯修改稿)
2025-07-22 03:34 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 到已用上述緩沖液預平衡的強陽離子交換柱層析（20cm），用相同緩沖洗脫未吸附蛋白。后用NaCl濃度梯度緩沖液階段洗脫吸附蛋白，一定的洗脫速率和時間分部收集，集中脂肪酶活性組分，用緩沖液透析。3）疏水色譜柱層析將透析后的酶液繼續(xù)用疏水柱層析( cm20 cm)層析，用相同緩沖液洗脫除去未吸附蛋白。然后用硫酸銨濃度梯度差緩沖液階段洗脫吸附蛋白，最后用 H2O 洗脫，一定的洗脫速率和時間分部收集，集中脂肪酶活性組分，透析除鹽。4）得到脂肪酶活性組分mRCL四．脂肪酶的化學修飾設計思路脂肪酶作為一種水解酶，不僅催化水解反應而 且催化有機相中酯合成和酯交換反應。有機相酶催 化技術自 20 世紀 80 年代開創(chuàng)以來，已獲得了巨大 的發(fā)展，廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)。 近幾年來人們?yōu)榱颂岣呙冈谟袡C相中的溶解性及穩(wěn) 定性，在酶的化學手段修飾和生物學手段修飾方面 開展了許多工作[1－6]。而化學修飾是提高和改變酶 催化性能的有效方法。Basri 等[7]用氨基酯的鹽酸鹽 對脂肪酶進行化學修飾，發(fā)現(xiàn)修飾酶在有機溶劑中的溶解度、熱穩(wěn)定性和催化酯化反應活性都有很大 提高。Tatsuo Maruyama 等[8]用硬脂酸修飾了脂肪 酶，發(fā)現(xiàn)雖然水解活性下降，但酯化活性明顯提高。 從文獻來看，就化學修飾改善酶催化功能方面而言，以前主要研究了修飾酶在有機相（均相）中的穩(wěn)定性、催化活性等問題，而涉及非均相界面催化的研 究甚少。表面活性劑是一類兼具親油基和親水基的兩 親物質(zhì)，它能富集于界面從而顯著地改變界面性質(zhì)。 修飾原理當水溶性的酶分子中引入長鏈烷基后，便具有了類似 于表面活性劑的兩親結構。因此與未經(jīng)修飾的酶相 比，修飾后的酶疏水性增強，界面活性提高，從而有 利于在有機相或界面催化化學反應，這對于酶的實 際應用具有重要意義。本文從界面化學的角度對用 N羥基琥珀酰亞胺活化的硬脂酸修飾的 Lipolase 脂 肪酶的界面化學性質(zhì)進行了研究，重點考察了修飾酶 降低表/界面張力的能力及界面催化活性。 1 實驗材料與方法 化學試劑及儀器化學試劑：Lipolase 100L，諾維信（中國）生物技術有限公司生產(chǎn)；N羥基琥珀酰亞胺，為生化試劑；硬脂酸及其他試劑，為國產(chǎn)分析純試劑，購自中國醫(yī)藥（集團）上海化學試劑公司。儀器：冷凍干燥儀（7934001 8917z01，USA），紫外可見分光光度計(UVIKON，Germany)，元素分析儀（Vario EL，Germany），表面張力儀（DCA315，USA)，界面張力儀（DVT30，Germany）及 LB 成膜裝置 LB5000（KSV5000，F(xiàn)inland)。 硬脂酸琥珀酰亞胺酯的制備活化后的硬脂酸易于與酶表面的氨基反應，因此先將硬脂酸活化。將硬脂酸溶入適量 N,N二甲基甲酰胺(DMF)中，并加入一定比例的 N羥基琥珀酰亞胺和二環(huán)己基碳酰亞胺。三者摩爾比為1∶∶[9－10]。磁力攪拌反應 8 h，反應溫度為 30 ℃。反應結束后過濾，濾液用乙醚萃取。蒸去乙醚得到白色固體，然后用無水乙醇反復洗滌后經(jīng)真空干燥即得。 Lipolase 脂肪酶的化學修飾在磁力攪拌下，將 Lipolase 100 L 用透析袋于去離子水中透析 2 天，冷凍干燥得到白色固體酶晶體。固體酶置于 5 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?00 mg 固體酶溶于 20 mL 磷酸二氫鉀–硼砂緩沖液（pH=），將 200 mg 硬脂酸琥珀酰亞胺酯溶于 5 mL DMF 后逐滴加入酶溶液。10 ℃下反應 10 h。反應完畢后，混合物在 4 000 r/mi
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