【文章內容簡介】 本染色：取三支試管：依次標記為 1 號管、2 號管和 3 號管，1 號管中依次加入 PECY5CD3 抗體、PECD8 抗體和 FITCCD 抗體 4 各 10μl，2 號管中依次加入 PECY5CD3 抗體、PECD56 抗體和 FITCCD19 抗體各 10μl，3 號管中依次加入 PECY5CD3 抗體、PECD8 抗體和 FITCCD28 抗體各 10μl，以上各管分別加入 EDTA 抗凝血 20μl，輕輕搖勻，置于室溫避光 20min，加入 溶血素，室溫避光 10min，1000r/min 離心 5min，棄上清，再加入 1ml 磷酸鹽緩沖液（PBS）混勻， 1000r/min 離心 5min，棄上清，再加入 1ml1%多聚甲醛溶液混勻固定細胞。置于 4℃避光保存并于 24h 內用流式細胞儀進行檢測。 上機檢測：流式細胞儀在使用前均經過光路與流路的校準、PMT 校準、顏色補償、并有專業(yè)人員進行操作等質控步驟。每次檢測 10000 個細胞，機器自帶軟件分析出 CD3+、CD3 +CD4+、CD3 +CD8+、CD3 CD19+、CD3 CD56+、CD3 +CD8+CD28+和 CD3+CD8+CD28細胞的百分比。 各亞群淋巴細胞計數通過血常規(guī)檢測出研究對象外周血總的淋巴細胞絕對數（10 9/L）,通過流式細胞術檢測得外周血淋巴細胞各群的百分比，根據下列公式計算出各亞群淋巴細胞的絕對數：各亞群淋巴細胞絕對數（個/μl 血液）= 淋巴細胞總數（10 9/L）各群淋巴細胞百分比（% ）10 3；CD3+CD8+CD28+細胞數（個 /μl 血液）= CD3+淋巴細胞數（個/μl）CD3+CD8+CD28+細胞百分比（%）；CD3+CD8+CD28細胞數（個/μl 血液）= CD3+淋巴細胞數（個/μl 血液）CD3+CD8+CD28細胞百分比（%）。15 統(tǒng)計學處理由于資料不符合正態(tài)和方差齊性，因此采用非參數法。用 統(tǒng)計軟件，三組間比較采用成組設計的多個獨立樣本比較的秩和檢驗（KruskalWallis 法），兩組間比較用兩獨立樣本的秩和檢驗（MannWhitney 法）。所有統(tǒng)計學檢驗均為雙側，顯著水平設為 α=。分析結果用中位數（最小值，最大值）表示。2 結果 肝功能測定結果 對 16 例 TCE 藥疹樣皮炎的病人血清 ALT 以及 AST 活性進行檢測，發(fā)現16 例病人中 ALT 水平升高者 15 例（%）；AST 升高者 12 例（%）。在接觸對照（32 例）與非接觸對照組（28 例）ALT 以及 AST 水平均在臨床正常參考值范圍內。 三組研究對象外周血白細胞五分類檢測結果16 例患者中外周血 LYMPH 有 6 例（%）高于正常參考值范圍，1 例（% ）低于正常參考值范圍；MONO 有 6 例（%）高于正常參考值范圍；NEUT 有 14 例（%） 高于正常參考值范圍；EO 有 8 例（50%）高于正常參考值范圍，2 例低于正常參考值范圍，BASO 有 8 例（50%）高于正常參考值范圍。在接觸對照組和非接觸對照組體內上述指標均在正常參考值范圍內。見表121。獲得 5 例病人在檢測血常規(guī)前未接受任何治療的血常規(guī)結果，5 例病人外周血中性粒細胞（NEUT ）水平均增高，為 ，平均 （10 9/L）。有 8 例病人在檢測淋巴細胞亞群前有明確的激素治療史，但激素的使用量不祥。 三組研究對象之間淋巴細胞亞群絕對數的比較結果總淋巴細胞數、T 細胞和 CD4+T 細胞絕對數均為病例組同時高于接觸對照組和非接觸對照組(P )，接觸對照組和非接觸對照組間無統(tǒng)計學差異(P)；NK 細胞絕對數為病例組接觸對照組非接觸對照組，組間差異有統(tǒng)計學意義( P)；CD8 +T 細胞和 CD8+CD28T 細胞數量排序均為病例組接觸16對照組非接觸對照組，差異有統(tǒng)計學意義；CD8 +CD28+T 細胞數病例組高于接觸對照組，差異有統(tǒng)計學意義，但病例組與非接觸對照組間無統(tǒng)計學差異。B細胞絕對數接觸對照組高于非接觸對照組(P)。CD4 +/CD8+細胞比值（P =）和 CD8+CD28+/CD8+CD28細胞比值（P=）三組間差異均有統(tǒng)計學意義，但病例組和接觸對照組、病例組與非接觸對照組之間均無統(tǒng)計學差異（P）。見表 122。對 8 例經過激素治療的病人與 8 例未經激素治療的病例外周血淋巴細胞進行比較分析，各亞群淋巴細胞、CD4 +/CD8+細胞比值、CD8 +CD28+T/CD8+T 以及 CD8+CD28+T/CD8+CD28T 細胞比值均未見顯著性差異（P ）。表 121 16 例 TCE 藥疹樣皮炎病人外周血白細胞五分類檢測結果分析LYMPH MONO NEUT EO BASO升高例數 6（%） 6（%） 14（%） 8（ 50%） 8（50% ）降低例數 1（%） 0 0 2（ %） 0正常例數 9（% ） 10（%） 2（%） 6（ %） 8（50% ）注：LYMPH,淋巴細胞；MONO,單核細胞；NEUT,中性粒細胞；EO,嗜酸性粒細胞；BASO,嗜堿性粒細胞。 表 122 三組研究對象之間外周血淋巴細胞亞群比較細胞亞群 非接觸對照組 接觸對照組 病例組 p p12 P13 P23CD3+CD4+(個/μl）中位數 **△ （最小值，最大值） （，） （，）（，）CD3+CD8+(個/μl）中位數 ** **△△ . （最小值，最大值） （，） （，） （，CD3+(個/μl）中位數 **△△ （最小值，最大值） （，）（，）（，）CD3CD19+(個/μl）中位數 ** （最小值，最大值） （，） （，） （，）CD3CD56+(個/μl）中位數 ** **△△ （最小值，最大值） （，） （，） （，）CD3+CD8+CD28+(個/μl）中位數 ** △△ （最小值，最大值） （，） （，） （，）18CD3+CD8+CD28(個/μl）中位數 ** **△ （最小值，最大值） （，） （，）（，）LYMPH(個/μl ）中位數 **△△ （最小值，最大值）（，）（，）（，）CD3+CD8+CD28+/CD3+CD8+ ** * （最小值，最大值） (,) (,) (,)CD4+/CD8+中位數 （最大值，最小值） (,) (,) (,)CD28+/CD28中位數 ** * （最大值，最小值） (,) (,) (,)注：*與非接觸對照組比較，P。**與非接觸對照組比較， P。 △與接觸對照組比較，P。 △△與接觸對照組比較，P。LYMPH:淋巴細胞總數. 注：p 為三組之間 KruskalWallis 法檢驗的 p 值，p12 為病例組與接觸對照組之間 MannWhitney 法檢驗 p 值，p13 為病例組與非接觸對照組之間 MannWhitney 法檢驗結果，p23 為接觸對照組與非接觸對照組之間 MannWhitney 法檢驗 p 值。 3 討論肝臟是 TCE 在體內代謝的主要器官，一般認為外源化學物在肝臟進行聚合、氧化、還原、氫化以及去甲基化等一系列的代謝過程，然后在全身多個臟器發(fā)揮毒效應。關于 TCE 對 TCE 藥疹樣皮炎患者肝功能的影響在國內外均有報道[2331]。目前認為 TCE 的中間代謝產物水合氯醛和三氯乙酸均能引起肝臟損害 [32]。但本研究中病例與接觸對照來自于相同工廠的相同車間，在暴露濃度相同的條件下，16 例 TCE 藥疹樣皮炎病人均存在不同程度的肝損傷，而接觸對照工人肝功能檢測指標均在正常參考值范圍內。并且在對 TCE 藥疹樣皮炎的整個治療的過程中，隨著皮疹的消退，肝功能恢復正常 [28]。所有這些均提示病例肝損傷并非由于 TCE 和/或其代謝產物的直接毒作用，而是屬于免疫介導的肝損傷。一般認為外周血白細胞分類計數的變化與機體疾病病程變化有著密切關系，在某些疾病的初期、急性期、恢復期各類白細胞比例不斷的變化。另外，激素也能導致機體白細胞和分類計數的變化，如激素使外周血中性粒細胞升高 [33]，而使血中嗜酸性粒細胞和淋巴細胞減少。TCE 藥疹樣皮炎以激素治療為主，本研究中有 8 例病人在檢測血常規(guī)前經過不同程度的激素治療，然而結果顯示有50%的病例嗜酸性粒細胞增高，%的病例淋巴細胞升高，此結果與激素作用所致兩類細胞減少的趨勢恰好相反；%的病例中性粒細胞升高雖與激素的作用趨勢相一致。但另外 5 例未經激素治療的病人檢查結果發(fā)現，外周血中性粒細胞均升高。因此，本研究血常規(guī)的檢測結果可以反映出患者在發(fā)病初期的基本情況，并可以排除激素的影響。研究表明中性粒細胞的增多則與肝損傷密切相關，中性粒細胞的增加可使肝損傷明顯加劇 [34]，其通過 Mac1 粘附于肝細胞，在趨化因子的作用下，啟動蛋白酶的釋放并持續(xù)生成活性氧 [35]。活性氧誘發(fā)肝細胞內氧化應激，線粒體穿膜轉運孔開放和線粒體膜電位崩落，引起肝細胞壞死 [36]。本次研究中發(fā)現病例組有占 %的病人中性粒細胞升高，提示 TCE 藥疹樣皮炎的患者體內，通過活化的中性粒細胞釋放出活性氧，誘導肝細胞的脂質過氧化，進而導致肝臟的損傷。因此在該病的治療期間要采取積極的治療措施，以防止肝功能衰竭而導致死亡。嗜酸性粒細胞參與機體的非特異性免疫反應，其主要特點之一是含有顆粒，大約 200 個/細胞，這些顆粒中含有強堿性的毒性蛋白，當嗜酸性粒細胞活化后，20脫顆粒形成毒性陽離子蛋白和炎性介質，對浸潤部位的組織和細胞產生強烈的毒性作用。嗜酸性粒細胞是判斷機體是否發(fā)生變態(tài)反應的簡易指標，其能增強皮膚炎癥反應，與接觸性皮炎發(fā)生部位的病例組織學改變之間具有密切關系，Satoh T 等 [37]應用豚鼠接觸性過敏反應模型，以 10%DNCB 致敏和 %DNCB涂抹耳部進行激發(fā)，12 小時耳部嗜酸性粒細胞數量顯著增加。本研究雖然只檢測了病例血液中嗜酸性粒細胞升高，而未檢測皮膚組織，然而研究表明，組織中嗜酸性粒細胞浸潤往往與外周血中嗜酸性粒細胞數量增多相關聯 [38]。嗜酸性粒細胞主要分布于呼吸道、消化道和泌尿生殖道粘膜組織中，當嗜酸性粒細胞被激活后，脫顆粒釋放出一系列生物活性介質，引起組織細胞的損傷，這一生物學過程可以解釋 TCE 過敏性皮炎病人出現的眼、口、生殖器等處的粘膜紅腫、糜爛等損傷 [39]。另外，研究表明嗜酸性粒細胞浸潤增多是由 T 細胞調控的繼發(fā)免疫反應，在藥物引起的非速發(fā)型變態(tài)反應中（NIRs），活化的 T 細胞通過分泌穿孔素（perforin ，PF）和顆粒酶 B（granzyme B，GrB ）等細胞因子，來誘導中性粒細胞、嗜酸性粒細胞以及角質細胞的活化 [40]。推測 TCE 藥疹樣皮炎患者可能也是通過同樣的機制導致外周血嗜酸性粒細胞的升高。盡管嗜堿性粒細胞（BASO）在外周血白細胞中所占的比例較小（1% ）[41，42] 。但近年來發(fā)現抗原活化的BASO在過敏性反應中發(fā)揮重要功能，原因是其能聚集于皮損部位并通過分泌Th2型細胞因子（如 IL4，IL13）以及趨化因子，直接或誘導聚集于表皮細胞的其它炎癥細胞釋放炎癥介質，進而導致皮膚損傷 [4247]。本次研究中發(fā)現，8例（50%）病人在發(fā)病的初期外周血BASO 升高，提示其通過釋放炎癥介質，參與了TCE藥疹樣皮炎的皮膚損傷。研究者普遍認為 TCE 藥疹樣皮炎是由于 TCE 引起的遲發(fā)型變態(tài)反應性疾病。以往的研究中通過淋巴細胞特異性增殖轉化實驗，均發(fā)現 TCE 藥疹樣皮炎的病人外周血淋巴細胞 [48]、TCE 致敏的小鼠脾淋巴細胞 [49]以及 TCE 致敏的 SD大鼠外周血淋巴細胞 [50] 在體外與 TCE 共培養(yǎng)后發(fā)生明顯的增殖或活性增強。三項研究均證明 TCE 可以作為致敏原誘導機體內致敏淋巴細胞的活化增殖。但由于淋巴細胞中既包括 T 淋巴細胞，也包括 B 淋巴細胞，這兩類執(zhí)行不同功能的免疫細胞（分別代表細胞免疫和體液免疫）究竟是哪一類發(fā)生了增殖，在以往的文章中均未見討論。本次研究結果發(fā)現，病例組外周血淋巴細胞總數顯著21高于接觸對照組和非接觸對照組，差異有統(tǒng)計學意義。其中 T 淋巴細胞數病例組明顯高于接觸對照組和非接觸對照組，而接觸對照組和非接觸對照組之間無統(tǒng)計學差異。B 淋巴細胞絕對數病例組與接觸對照組以及非接觸對照組之間均無統(tǒng)計學差異。提示 TCE 藥疹樣皮炎的發(fā)生與 T 細胞介導的細胞免疫反應有關。以往的研究證明糖皮質激素作為類固醇激素，其主要通過誘導 T、B 淋巴細胞的凋亡進而發(fā)揮抗炎、免疫抑制和抗腫瘤作用 [5153]。如利美索龍（一種糖皮質激素）和地塞米松能抑制 T 淋巴細胞的增殖 [54]。但本研究中發(fā)現 TCE 藥疹樣皮炎患者外周血中總淋巴細胞數增多，其中 T 淋巴細胞發(fā)生了顯著增殖，此結果與激素的治療作用相反，進一步證實 TCE 藥疹樣皮炎的發(fā)病機制與 T 淋巴細胞介導的細胞免疫有關，因此本節(jié)的研究結果可排除激素治療的影響。本實驗結果顯示，外周血淋巴細胞總數、T 細胞、 CD4+T 細胞在病例組均明顯高于接觸對照組和非接觸對照組，同時這 3 個指標在接觸對照組和非接觸對照組之間無統(tǒng)計學差異，提示這 3 個指標可作為 TCE 接觸工人發(fā)生藥疹樣皮炎的早期篩檢指標。而 CD8+T 細胞病例組接觸對照組非接觸對照組，各組間均有顯著性差異，因此其只能作為反映 TCE 接觸的指標