【文章內(nèi)容簡介】 本染色：取三支試管：依次標(biāo)記為 1 號管、2 號管和 3 號管，1 號管中依次加入 PECY5CD3 抗體、PECD8 抗體和 FITCCD 抗體 4 各 10μl，2 號管中依次加入 PECY5CD3 抗體、PECD56 抗體和 FITCCD19 抗體各 10μl，3 號管中依次加入 PECY5CD3 抗體、PECD8 抗體和 FITCCD28 抗體各 10μl，以上各管分別加入 EDTA 抗凝血 20μl，輕輕搖勻，置于室溫避光 20min，加入 溶血素，室溫避光 10min，1000r/min 離心 5min，棄上清，再加入 1ml 磷酸鹽緩沖液（PBS）混勻， 1000r/min 離心 5min，棄上清，再加入 1ml1%多聚甲醛溶液混勻固定細(xì)胞。置于 4℃避光保存并于 24h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。 上機(jī)檢測：流式細(xì)胞儀在使用前均經(jīng)過光路與流路的校準(zhǔn)、PMT 校準(zhǔn)、顏色補(bǔ)償、并有專業(yè)人員進(jìn)行操作等質(zhì)控步驟。每次檢測 10000 個細(xì)胞，機(jī)器自帶軟件分析出 CD3+、CD3 +CD4+、CD3 +CD8+、CD3 CD19+、CD3 CD56+、CD3 +CD8+CD28+和 CD3+CD8+CD28細(xì)胞的百分比。 各亞群淋巴細(xì)胞計數(shù)通過血常規(guī)檢測出研究對象外周血總的淋巴細(xì)胞絕對數(shù)（10 9/L）,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測得外周血淋巴細(xì)胞各群的百分比，根據(jù)下列公式計算出各亞群淋巴細(xì)胞的絕對數(shù)：各亞群淋巴細(xì)胞絕對數(shù)（個/μl 血液）= 淋巴細(xì)胞總數(shù)（10 9/L）各群淋巴細(xì)胞百分比（% ）10 3；CD3+CD8+CD28+細(xì)胞數(shù)（個 /μl 血液）= CD3+淋巴細(xì)胞數(shù)（個/μl）CD3+CD8+CD28+細(xì)胞百分比（%）；CD3+CD8+CD28細(xì)胞數(shù)（個/μl 血液）= CD3+淋巴細(xì)胞數(shù)（個/μl 血液）CD3+CD8+CD28細(xì)胞百分比（%）。15 統(tǒng)計學(xué)處理由于資料不符合正態(tài)和方差齊性，因此采用非參數(shù)法。用 統(tǒng)計軟件，三組間比較采用成組設(shè)計的多個獨(dú)立樣本比較的秩和檢驗（KruskalWallis 法），兩組間比較用兩獨(dú)立樣本的秩和檢驗（MannWhitney 法）。所有統(tǒng)計學(xué)檢驗均為雙側(cè)，顯著水平設(shè)為 α=。分析結(jié)果用中位數(shù)（最小值，最大值）表示。2 結(jié)果 肝功能測定結(jié)果 對 16 例 TCE 藥疹樣皮炎的病人血清 ALT 以及 AST 活性進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)16 例病人中 ALT 水平升高者 15 例（%）；AST 升高者 12 例（%）。在接觸對照（32 例）與非接觸對照組（28 例）ALT 以及 AST 水平均在臨床正常參考值范圍內(nèi)。 三組研究對象外周血白細(xì)胞五分類檢測結(jié)果16 例患者中外周血 LYMPH 有 6 例（%）高于正常參考值范圍，1 例（% ）低于正常參考值范圍；MONO 有 6 例（%）高于正常參考值范圍；NEUT 有 14 例（%） 高于正常參考值范圍；EO 有 8 例（50%）高于正常參考值范圍，2 例低于正常參考值范圍，BASO 有 8 例（50%）高于正常參考值范圍。在接觸對照組和非接觸對照組體內(nèi)上述指標(biāo)均在正常參考值范圍內(nèi)。見表121。獲得 5 例病人在檢測血常規(guī)前未接受任何治療的血常規(guī)結(jié)果，5 例病人外周血中性粒細(xì)胞（NEUT ）水平均增高，為 ，平均 （10 9/L）。有 8 例病人在檢測淋巴細(xì)胞亞群前有明確的激素治療史，但激素的使用量不祥。 三組研究對象之間淋巴細(xì)胞亞群絕對數(shù)的比較結(jié)果總淋巴細(xì)胞數(shù)、T 細(xì)胞和 CD4+T 細(xì)胞絕對數(shù)均為病例組同時高于接觸對照組和非接觸對照組(P )，接觸對照組和非接觸對照組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P)；NK 細(xì)胞絕對數(shù)為病例組接觸對照組非接觸對照組，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P)；CD8 +T 細(xì)胞和 CD8+CD28T 細(xì)胞數(shù)量排序均為病例組接觸16對照組非接觸對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；CD8 +CD28+T 細(xì)胞數(shù)病例組高于接觸對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但病例組與非接觸對照組間無統(tǒng)計學(xué)差異。B細(xì)胞絕對數(shù)接觸對照組高于非接觸對照組(P)。CD4 +/CD8+細(xì)胞比值（P =）和 CD8+CD28+/CD8+CD28細(xì)胞比值（P=）三組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，但病例組和接觸對照組、病例組與非接觸對照組之間均無統(tǒng)計學(xué)差異（P）。見表 122。對 8 例經(jīng)過激素治療的病人與 8 例未經(jīng)激素治療的病例外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行比較分析，各亞群淋巴細(xì)胞、CD4 +/CD8+細(xì)胞比值、CD8 +CD28+T/CD8+T 以及 CD8+CD28+T/CD8+CD28T 細(xì)胞比值均未見顯著性差異（P ）。表 121 16 例 TCE 藥疹樣皮炎病人外周血白細(xì)胞五分類檢測結(jié)果分析LYMPH MONO NEUT EO BASO升高例數(shù) 6（%） 6（%） 14（%） 8（ 50%） 8（50% ）降低例數(shù) 1（%） 0 0 2（ %） 0正常例數(shù) 9（% ） 10（%） 2（%） 6（ %） 8（50% ）注：LYMPH,淋巴細(xì)胞；MONO,單核細(xì)胞；NEUT,中性粒細(xì)胞；EO,嗜酸性粒細(xì)胞；BASO,嗜堿性粒細(xì)胞。 表 122 三組研究對象之間外周血淋巴細(xì)胞亞群比較細(xì)胞亞群 非接觸對照組 接觸對照組 病例組 p p12 P13 P23CD3+CD4+(個/μl）中位數(shù) **△ （最小值，最大值） （，） （，）（，）CD3+CD8+(個/μl）中位數(shù) ** **△△ . （最小值，最大值） （，） （，） （，CD3+(個/μl）中位數(shù) **△△ （最小值，最大值） （，）（，）（，）CD3CD19+(個/μl）中位數(shù) ** （最小值，最大值） （，） （，） （，）CD3CD56+(個/μl）中位數(shù) ** **△△ （最小值，最大值） （，） （，） （，）CD3+CD8+CD28+(個/μl）中位數(shù) ** △△ （最小值，最大值） （，） （，） （，）18CD3+CD8+CD28(個/μl）中位數(shù) ** **△ （最小值，最大值） （，） （，）（，）LYMPH(個/μl ）中位數(shù) **△△ （最小值，最大值）（，）（，）（，）CD3+CD8+CD28+/CD3+CD8+ ** * （最小值，最大值） (,) (,) (,)CD4+/CD8+中位數(shù) （最大值，最小值） (,) (,) (,)CD28+/CD28中位數(shù) ** * （最大值，最小值） (,) (,) (,)注：*與非接觸對照組比較，P。**與非接觸對照組比較， P。 △與接觸對照組比較，P。 △△與接觸對照組比較，P。LYMPH:淋巴細(xì)胞總數(shù). 注：p 為三組之間 KruskalWallis 法檢驗的 p 值，p12 為病例組與接觸對照組之間 MannWhitney 法檢驗 p 值，p13 為病例組與非接觸對照組之間 MannWhitney 法檢驗結(jié)果，p23 為接觸對照組與非接觸對照組之間 MannWhitney 法檢驗 p 值。 3 討論肝臟是 TCE 在體內(nèi)代謝的主要器官，一般認(rèn)為外源化學(xué)物在肝臟進(jìn)行聚合、氧化、還原、氫化以及去甲基化等一系列的代謝過程，然后在全身多個臟器發(fā)揮毒效應(yīng)。關(guān)于 TCE 對 TCE 藥疹樣皮炎患者肝功能的影響在國內(nèi)外均有報道[2331]。目前認(rèn)為 TCE 的中間代謝產(chǎn)物水合氯醛和三氯乙酸均能引起肝臟損害 [32]。但本研究中病例與接觸對照來自于相同工廠的相同車間，在暴露濃度相同的條件下，16 例 TCE 藥疹樣皮炎病人均存在不同程度的肝損傷，而接觸對照工人肝功能檢測指標(biāo)均在正常參考值范圍內(nèi)。并且在對 TCE 藥疹樣皮炎的整個治療的過程中，隨著皮疹的消退，肝功能恢復(fù)正常 [28]。所有這些均提示病例肝損傷并非由于 TCE 和/或其代謝產(chǎn)物的直接毒作用，而是屬于免疫介導(dǎo)的肝損傷。一般認(rèn)為外周血白細(xì)胞分類計數(shù)的變化與機(jī)體疾病病程變化有著密切關(guān)系，在某些疾病的初期、急性期、恢復(fù)期各類白細(xì)胞比例不斷的變化。另外，激素也能導(dǎo)致機(jī)體白細(xì)胞和分類計數(shù)的變化，如激素使外周血中性粒細(xì)胞升高 [33]，而使血中嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞減少。TCE 藥疹樣皮炎以激素治療為主，本研究中有 8 例病人在檢測血常規(guī)前經(jīng)過不同程度的激素治療，然而結(jié)果顯示有50%的病例嗜酸性粒細(xì)胞增高，%的病例淋巴細(xì)胞升高，此結(jié)果與激素作用所致兩類細(xì)胞減少的趨勢恰好相反；%的病例中性粒細(xì)胞升高雖與激素的作用趨勢相一致。但另外 5 例未經(jīng)激素治療的病人檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外周血中性粒細(xì)胞均升高。因此，本研究血常規(guī)的檢測結(jié)果可以反映出患者在發(fā)病初期的基本情況，并可以排除激素的影響。研究表明中性粒細(xì)胞的增多則與肝損傷密切相關(guān)，中性粒細(xì)胞的增加可使肝損傷明顯加劇 [34]，其通過 Mac1 粘附于肝細(xì)胞，在趨化因子的作用下，啟動蛋白酶的釋放并持續(xù)生成活性氧 [35]?；钚匝跽T發(fā)肝細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，線粒體穿膜轉(zhuǎn)運(yùn)孔開放和線粒體膜電位崩落，引起肝細(xì)胞壞死 [36]。本次研究中發(fā)現(xiàn)病例組有占 %的病人中性粒細(xì)胞升高，提示 TCE 藥疹樣皮炎的患者體內(nèi)，通過活化的中性粒細(xì)胞釋放出活性氧，誘導(dǎo)肝細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟的損傷。因此在該病的治療期間要采取積極的治療措施，以防止肝功能衰竭而導(dǎo)致死亡。嗜酸性粒細(xì)胞參與機(jī)體的非特異性免疫反應(yīng)，其主要特點(diǎn)之一是含有顆粒，大約 200 個/細(xì)胞，這些顆粒中含有強(qiáng)堿性的毒性蛋白，當(dāng)嗜酸性粒細(xì)胞活化后，20脫顆粒形成毒性陽離子蛋白和炎性介質(zhì)，對浸潤部位的組織和細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的毒性作用。嗜酸性粒細(xì)胞是判斷機(jī)體是否發(fā)生變態(tài)反應(yīng)的簡易指標(biāo)，其能增強(qiáng)皮膚炎癥反應(yīng)，與接觸性皮炎發(fā)生部位的病例組織學(xué)改變之間具有密切關(guān)系，Satoh T 等 [37]應(yīng)用豚鼠接觸性過敏反應(yīng)模型，以 10%DNCB 致敏和 %DNCB涂抹耳部進(jìn)行激發(fā)，12 小時耳部嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量顯著增加。本研究雖然只檢測了病例血液中嗜酸性粒細(xì)胞升高，而未檢測皮膚組織，然而研究表明，組織中嗜酸性粒細(xì)胞浸潤往往與外周血中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量增多相關(guān)聯(lián) [38]。嗜酸性粒細(xì)胞主要分布于呼吸道、消化道和泌尿生殖道粘膜組織中，當(dāng)嗜酸性粒細(xì)胞被激活后，脫顆粒釋放出一系列生物活性介質(zhì)，引起組織細(xì)胞的損傷，這一生物學(xué)過程可以解釋 TCE 過敏性皮炎病人出現(xiàn)的眼、口、生殖器等處的粘膜紅腫、糜爛等損傷 [39]。另外，研究表明嗜酸性粒細(xì)胞浸潤增多是由 T 細(xì)胞調(diào)控的繼發(fā)免疫反應(yīng)，在藥物引起的非速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)中（NIRs），活化的 T 細(xì)胞通過分泌穿孔素（perforin ，PF）和顆粒酶 B（granzyme B，GrB ）等細(xì)胞因子，來誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞以及角質(zhì)細(xì)胞的活化 [40]。推測 TCE 藥疹樣皮炎患者可能也是通過同樣的機(jī)制導(dǎo)致外周血嗜酸性粒細(xì)胞的升高。盡管嗜堿性粒細(xì)胞（BASO）在外周血白細(xì)胞中所占的比例較?。?% ）[41，42] 。但近年來發(fā)現(xiàn)抗原活化的BASO在過敏性反應(yīng)中發(fā)揮重要功能，原因是其能聚集于皮損部位并通過分泌Th2型細(xì)胞因子（如 IL4，IL13）以及趨化因子，直接或誘導(dǎo)聚集于表皮細(xì)胞的其它炎癥細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致皮膚損傷 [4247]。本次研究中發(fā)現(xiàn)，8例（50%）病人在發(fā)病的初期外周血BASO 升高，提示其通過釋放炎癥介質(zhì)，參與了TCE藥疹樣皮炎的皮膚損傷。研究者普遍認(rèn)為 TCE 藥疹樣皮炎是由于 TCE 引起的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)性疾病。以往的研究中通過淋巴細(xì)胞特異性增殖轉(zhuǎn)化實驗，均發(fā)現(xiàn) TCE 藥疹樣皮炎的病人外周血淋巴細(xì)胞 [48]、TCE 致敏的小鼠脾淋巴細(xì)胞 [49]以及 TCE 致敏的 SD大鼠外周血淋巴細(xì)胞 [50] 在體外與 TCE 共培養(yǎng)后發(fā)生明顯的增殖或活性增強(qiáng)。三項研究均證明 TCE 可以作為致敏原誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)致敏淋巴細(xì)胞的活化增殖。但由于淋巴細(xì)胞中既包括 T 淋巴細(xì)胞，也包括 B 淋巴細(xì)胞，這兩類執(zhí)行不同功能的免疫細(xì)胞（分別代表細(xì)胞免疫和體液免疫）究竟是哪一類發(fā)生了增殖，在以往的文章中均未見討論。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病例組外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)顯著21高于接觸對照組和非接觸對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其中 T 淋巴細(xì)胞數(shù)病例組明顯高于接觸對照組和非接觸對照組，而接觸對照組和非接觸對照組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。B 淋巴細(xì)胞絕對數(shù)病例組與接觸對照組以及非接觸對照組之間均無統(tǒng)計學(xué)差異。提示 TCE 藥疹樣皮炎的發(fā)生與 T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)有關(guān)。以往的研究證明糖皮質(zhì)激素作為類固醇激素，其主要通過誘導(dǎo) T、B 淋巴細(xì)胞的凋亡進(jìn)而發(fā)揮抗炎、免疫抑制和抗腫瘤作用 [5153]。如利美索龍（一種糖皮質(zhì)激素）和地塞米松能抑制 T 淋巴細(xì)胞的增殖 [54]。但本研究中發(fā)現(xiàn) TCE 藥疹樣皮炎患者外周血中總淋巴細(xì)胞數(shù)增多，其中 T 淋巴細(xì)胞發(fā)生了顯著增殖，此結(jié)果與激素的治療作用相反，進(jìn)一步證實 TCE 藥疹樣皮炎的發(fā)病機(jī)制與 T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫有關(guān)，因此本節(jié)的研究結(jié)果可排除激素治療的影響。本實驗結(jié)果顯示，外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)、T 細(xì)胞、 CD4+T 細(xì)胞在病例組均明顯高于接觸對照組和非接觸對照組，同時這 3 個指標(biāo)在接觸對照組和非接觸對照組之間無統(tǒng)計學(xué)差異，提示這 3 個指標(biāo)可作為 TCE 接觸工人發(fā)生藥疹樣皮炎的早期篩檢指標(biāo)。而 CD8+T 細(xì)胞病例組接觸對照組非接觸對照組，各組間均有顯著性差異，因此其只能作為反映 TCE 接觸的指標(biāo)