金銀花內(nèi)生真菌分離及其次生代謝產(chǎn)物相關(guān)性研究分析畢業(yè)論文(編輯修改稿)
2025-07-17 12:46 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 來(lái)水洗凈，采用以下5種不同的消毒方法分別進(jìn)行表面消毒。E1：75%乙醇30s，%升汞2min，無(wú)菌水沖洗3次。E2: 75%乙醇30s,無(wú)菌水沖洗3次，8%次氯酸鈉5min,無(wú)菌水沖洗5次。E3：5%次氯酸鈉5min，無(wú)菌水沖洗3次。E4：%升汞1min,75%乙醇1min，無(wú)菌水沖洗3次。E5：75%乙醇5min,無(wú)菌水沖洗3次。 取最后一次消毒的無(wú)菌水200181。L置入培養(yǎng)基內(nèi)表面，作為對(duì)照，以確定分離得到的是植株組織內(nèi)生菌而不是組織表面未消毒徹底的菌。，接種于PDA培養(yǎng)基和NA培養(yǎng)基上，并取最后一次消毒無(wú)菌水用無(wú)菌棉簽涂抹于PDA、NA培養(yǎng)基上，作為對(duì)照，將培養(yǎng)基置于28℃暗室培養(yǎng)5天，定時(shí)觀察，當(dāng)有新的菌絲或菌落出現(xiàn)時(shí)轉(zhuǎn)接至新的PDA或NA培養(yǎng)基上，直至純化為單一菌落為止，采用PDA或NA試管斜面保存已純化的菌種，各兩只。將發(fā)酵好的內(nèi)生菌液體發(fā)酵液離心(10000r/min)10min，過濾，濃縮，加甲醇溶解，定容至5ml，置進(jìn)樣小瓶中備用。(TLC)檢測(cè)綠原酸 將處理后的發(fā)酵提取液適當(dāng)濃縮作為供試品溶液。另取綠原酸對(duì)照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（2010年中國(guó)藥典附錄ⅥB）實(shí)驗(yàn)，吸取供試品試液10~20181。l,對(duì)照品溶液10181。l，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上；以乙酸丁酯：甲酸：水=7：：，展開，取出，晾干， FeCl3顯色劑顯色。(TLC)檢測(cè)木犀草苷將處理后的發(fā)酵提取液適當(dāng)濃縮作為供試品溶液。照薄層色譜法（2010年中國(guó)藥典附錄ⅥB）實(shí)驗(yàn)，吸取供試品試液10181。l,對(duì)照品溶液10181。l，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上；以三氯甲烷：甲醇：甲酸=5:1:，展開，取出，晾干，F(xiàn)eCl3顯色劑顯色。(HPLC)檢測(cè)綠原酸：參照《2010版藥典》進(jìn)行測(cè)定，色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈：%磷酸溶液（13：87）為流動(dòng)相；流速1ml/min；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)327nm；進(jìn)樣量10181。L，理論塔板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于1000。(HPLC)檢測(cè)木犀草苷：參照《2010版藥典》進(jìn)行測(cè)定，色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 用苯基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Agilent ZORBAX SBphenyl 250mm,5181。m），以乙腈為流動(dòng)相A，%冰醋酸溶液為流動(dòng)相B，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為350nm，理論塔板數(shù)按木犀草苷峰計(jì)算不低于20000.表1 木犀草苷梯度洗脫時(shí)間（分鐘）流動(dòng)相A(%)流動(dòng)相B（%）0～1510～2090～8015～30208030～4020～3080～70測(cè)定方法：分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10181。L，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。對(duì)于內(nèi)生真菌的形態(tài)鑒定，主要通過觀察其孢子形態(tài)以及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、產(chǎn)孢方式等來(lái)進(jìn)行，如果更加準(zhǔn)確的鑒定需要做分子生物方面的研究，由于時(shí)間的限制，未對(duì)菌株做分子生物學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)，目前主要對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，方法如下：挑取純化的真菌菌絲，分別接種于PDA和察氏培養(yǎng)基上，采用3點(diǎn)接種法培養(yǎng)，肉眼觀察菌落正反面特征；采用插片培養(yǎng)法對(duì)孢子進(jìn)行顯微觀察。參照《真菌鑒定手冊(cè)》[4]進(jìn)行鑒定，可將內(nèi)生菌初步將其鑒定到屬水平。為了使內(nèi)生菌產(chǎn)生此生代謝產(chǎn)物的效率更高，對(duì)內(nèi)生菌二次發(fā)酵的培養(yǎng)基的碳源、氮源以及培養(yǎng)溫度做了進(jìn)一步的優(yōu)化，以選擇出的最適固體培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，分別用以下碳源代替培養(yǎng)基中的碳源：葡萄糖、蔗糖、淀粉、麥芽糖。培養(yǎng)條件及測(cè)定同液體培養(yǎng)基的選擇。以選擇出的最適固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，供試氮源分別為硝酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、尿素。培養(yǎng)條件及測(cè)定同液體培養(yǎng)基的選擇。以選擇出的最適固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別在26℃、28℃、30℃和32℃條件下?lián)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)條件及測(cè)定
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